 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1198 | 回復(fù): 0 | |||
Abbkine亞科因新蟲 (初入文壇)
|
[交流]
細(xì)胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒（離心柱式）實(shí)驗(yàn)操作原理
|
|
原理 細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，核酸內(nèi)切酶激活，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200 bp或其整倍數(shù)的DNA Ladder。DNA Ladder是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，通常觀察到DNA ladder，就可以判定細(xì)胞發(fā)生了凋亡。細(xì)胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒（離心柱式）通過DNA純化柱方式抽提DNA Ladder，比用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易損失，可以非常有效地抽提最小片斷為180-200bp的DNA Ladder，同時(shí)又可以抽提到50 kb以上的基因組DNA。 自備耗材 ·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、離心管 ·離心機(jī)、渦旋振蕩器 ·水浴鍋、凝膠電泳儀 ·無水乙醇、PBS ·瓊脂糖、TAE、Loading Buffer、DNA Marker、EB 試劑準(zhǔn)備 Lysis Buffer A：即用型；室溫保存。 Lysis Buffer B：即用型；室溫保存。 Wash Buffer A：第一次使用前50 T添加9 mL無水乙醇，100 T添加18 mL無水乙醇，混勻并做好標(biāo)記；室溫保存。 Wash Buffer B：第一次使用前50 T添加32 mL無水乙醇，100 T添加64 mL無水乙醇，混勻并做好標(biāo)記；室溫保存。 Elution Buffer：即用型；室溫保存。 RNase A：即用型；-20℃保存。 Proteinase K：即用型；-20℃保存。 實(shí)驗(yàn)步驟 注意：需使用56℃或70℃水浴，請(qǐng)?zhí)崆白骱脺?zhǔn)備。 A.細(xì)胞樣本 1.收集約1×106個(gè)細(xì)胞，加入200 μL PBS，輕柔混勻，使細(xì)胞重懸于PBS中。 注意：如果使用凍存的細(xì)胞沉淀，先把細(xì)胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS重懸細(xì)胞。 2.加入2 μL RNase A，輕柔渦旋混勻,室溫放置3-5 min。 3.加入10 μL Proteinase K，輕柔渦旋混勻。 4.加入200 μL Lysis Buffer B，輕柔渦旋混勻，70℃孵育10 min。 注意：加入 Lysis Buffer B后必須立即渦旋混勻。不可把Proteinase K直接和Lysis Buffer B混合。 5.加入200 μL無水乙醇，輕柔渦旋混勻。 注意：加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正�，F(xiàn)象。 6.把步驟5中的混合物（包括可能產(chǎn)生的沉淀）加入到Spin Column。12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 注意：進(jìn)行本步驟前需將Spin Column置于Collection Tube上。倒棄廢液后回收Collection Tube。必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到Spin Column內(nèi)，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果。 7.加入0.5 mL Wash Buffer A（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 8.加入0.6 mL Wash Buffer B（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心1 min，倒棄Collection Tube內(nèi)液體。 9.12,000 rpm離心2 min，去除殘留的乙醇。 10.將Spin Column置于一新的1.5 mL離心管上，開蓋室溫干燥3-5 min，加入50-100 μL Elution Buffer。室溫放置 1-3 min。12,000 rpm離心1-2 min。所得液體即為純化得到的總DNA。 注意：為提高DNA提取量，可以將Elution Buffer預(yù)熱至56℃再洗脫，也可將第一次洗脫所得溶液重新加入Spin Column進(jìn)行洗脫。 11.取部分抽提得到的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。 注意：如果細(xì)胞發(fā)生凋亡，即可觀察到典型的 DNA Ladder。電泳時(shí)一定要注意換用新鮮配制的電泳液，DNA凝膠也要用新鮮配制的電泳液配制并新鮮配制后使用。電泳時(shí)為獲取最佳的電泳效果使Ladder充分分開，電泳速度宜適當(dāng)慢一些，凝膠宜適當(dāng)長一些，而加樣孔宜更加扁平一些。選取適當(dāng)較薄的梳齒，往往會(huì)獲得更好的Ladder電泳效果。 B.動(dòng)物組織樣本 注意：與培養(yǎng)細(xì)胞相比，動(dòng)物組織樣本凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的部位不定、規(guī)律性差，取樣部位及取樣量的不同，均會(huì)顯著影響最終DNA Ladder的提取效果，建議有豐富經(jīng)驗(yàn)的用戶使用本試劑盒提取組織凋亡DNA Ladder。 1.稱取不超過25 mg的組織（脾臟不超過10 mg），剪切成盡可能小的碎片，加入190 μL Lysis Buffer A。 注意：請(qǐng)勿使用過多的樣品，過多的樣品會(huì)導(dǎo)致抽提效果下降。較小的組織碎片會(huì)使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可。 2.加入10 μL Proteinase K，輕柔渦旋混勻，56℃孵育直至完全裂解。 注意：在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時(shí)間因組織不同而有所不同，通�？稍�1-3 h內(nèi)完成。為方便起見，可以直接裂解過夜，裂解過夜對(duì)抽提效果無任何負(fù)面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應(yīng)該呈可把Spin Column堵住的凝膠狀。如果消化過夜仍呈凝膠狀，說明樣品用量過多，作為補(bǔ)救措施，可以把整個(gè)反應(yīng)體系放大一倍。也可組織樣本經(jīng)液氮研磨成面粉狀，縮短裂解時(shí)間。 3.加入2 μL RNase A，輕柔渦旋混勻,室溫放置3-5 min。 4.渦旋混勻15 s，加入200 μL Lysis Buffer B，渦旋混勻，70℃孵育10 min。 注意：加入Lysis Buffer B后需立即渦旋混勻。加入Lysis Buffer B后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會(huì)溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會(huì)形成凝膠狀物，此時(shí)需劇烈晃動(dòng)或渦旋樣品，以盡量破壞凝膠狀物。 5.后續(xù)步驟同A.5-A.11細(xì)胞樣本的步驟。 注意事項(xiàng) 1.溫度較低時(shí)Lysis Buffer A和Lysis Buffer B中可能會(huì)有沉淀產(chǎn)生，屬正常現(xiàn)象。如有沉淀，56℃水浴孵育溶解沉淀，混勻后使用。 2.本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，所有離心也均在室溫進(jìn)行。 3.Collection Tube在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
歡迎211本科同學(xué)，過A區(qū)國家線，A區(qū)非偏遠(yuǎn)一本，交叉學(xué)科課題組
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
成果系統(tǒng)訪問量大，請(qǐng)15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請(qǐng)諒解。
已經(jīng)有14人回復(fù)
-
281電子信息求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
材料277分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
求調(diào)劑院校
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
293求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
化學(xué) 0703求調(diào)劑 總分293 一志愿211
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
320材料一志愿西工大專碩英二數(shù)二 有兩年光伏工作經(jīng)驗(yàn)
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
材料328求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 Abbkine亞科因 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070300化學(xué) 280 一志愿太原理工 求調(diào)劑 +7 | 拾玖壹 2026-03-04 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 286 +6 | ksncj 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿東北大學(xué)080500，英一數(shù)二343分求調(diào)劑 +4 | Seele_v5 2026-03-04 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國金及主持省級(jí)大創(chuàng)經(jīng)歷 +6 | 熊境喆 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 +5 | 2103240126 2026-03-02 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 312求調(diào)劑 +8 | 醋精華了一下發(fā)?/a> 2026-03-03 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 我是小小蔥蔥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿西交大材料學(xué)碩 346 求調(diào)劑 +3 | zju51 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿西工大材料學(xué)，英一數(shù)二總分321分，求調(diào)劑。 +3 | zz05zz 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考博] 26申博 求博導(dǎo) +3 | 愛讀書的小帥 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿中科大能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大 +3 | 邵11 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 計(jì)算機(jī)學(xué)碩 分?jǐn)?shù)285求調(diào)劑
+4
|
glwshine 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料工程求調(diào)劑 +3 | 1431251 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
通訊作者寫誰，問題是你意想不到的問題
 15+3
|
阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 338求調(diào)劑 +5 | 18162027187 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +9 | 滿頭大汗的學(xué)生 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 085600材料工程一志愿中科大總分312求調(diào)劑 +9 | 吃宵夜1 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 265分求調(diào)劑不調(diào)專業(yè)和學(xué)校有行學(xué)上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 313求調(diào)劑 +3 | 水流年lc 2026-02-28 | 3/150 |
|