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青云1234新蟲(chóng) (小有名氣)
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大鼠褪黑素（MT）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）使用指南
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大鼠褪黑素（MT）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）使用指南 大鼠褪黑素（MT）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）專(zhuān)為科研工作者設(shè)計(jì)，用于定量檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液及組織中的大鼠褪黑素（MT）含量。在使用本試劑盒前，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)研讀本說(shuō)明書(shū)。 實(shí)驗(yàn)原理 本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法。預(yù)先包被褪黑素（MT）抗體的微孔板中，依次加入樣本 / 校準(zhǔn)品和 Asaay Diluent，溫育洗滌后，加入 SA - HRP 再次溫育。經(jīng)二次洗滌，加入底物 TMB 顯色，室溫反應(yīng)后用終止液終止，通過(guò)讀取 OD 值實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。OD 值與樣品中褪黑素（MT）含量呈負(fù)相關(guān)。該試劑盒具備靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)勢(shì)，對(duì)血清中褪黑素（MT）含量的變化具備可靠的檢出能力。 試劑盒限制 本試劑盒僅用于科研，嚴(yán)禁用于臨床診斷。 請(qǐng)?jiān)谠噭┖袠?biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品切勿使用。 請(qǐng)勿與其他廠家的試劑盒或組分混用。 若樣品需稀釋?zhuān)墒褂?PBS（PH7.4）。 若樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度，需適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定。 檢測(cè)前需排除待測(cè)樣本中可能存在的異嗜抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。 本試劑盒測(cè)定結(jié)果與通過(guò)其他方法得到的結(jié)果不具有直接可比性。 技術(shù)提示 混合蛋白溶液時(shí)，注意避免起泡。 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分懸臂加樣，防止交叉污染。 確保合適的溫育時(shí)間和充分的洗滌步驟，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入 30 秒浸泡步驟可提高檢測(cè)精度。 底物溶液應(yīng)為無(wú)色液體，若保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，表明已失效，不可使用。 終止液加樣順序與底物溶液一致，加入后藍(lán)色底物產(chǎn)物會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。 實(shí)驗(yàn)用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋密封，低溫干燥保存。 所有液體組分使用前需充分搖勻，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)的時(shí)間、加樣量及順序進(jìn)行溫育操作。 試劑盒組分與保存 未開(kāi)封的試劑盒應(yīng)保存在 2 - 8℃，過(guò)期試劑盒禁止使用。其組分包括： 校準(zhǔn)品：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原配制的 6 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度依次為 80、40、20、10、5、0pg/mL。 包被微孔板：有 96T/48T 規(guī)格，預(yù)包被固相抗體。 SA - HRP：12mL，為 HRP 標(biāo)記物。 Asaay Diluent：12mL，用于分離 MT 與結(jié)合蛋白。 TMB：12mL，TMB 工作液。 終止液：12mL，2mol/L 稀釋液。 20× 濃縮洗滌液：30mL，含 0.15% Tween20 的 PBS。 說(shuō)明書(shū)：1 份。 自封袋：1 個(gè)。 不干膠：2 片。 其他用品 實(shí)驗(yàn)需準(zhǔn)備酶標(biāo)儀（450nm）、精密移液器及一次性吸頭、蒸餾水、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)、37℃水浴鍋或恒溫箱、500ml 量筒。 生物安全 檢測(cè)需符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和廢棄物都應(yīng)按傳染物處置。 試劑盒液體組分含 proclin - 300 防腐劑，可能引起皮膚過(guò)敏，避免吸入煙霧與皮膚接觸。 底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激，避免吸入煙霧。 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)手套，完成后徹底洗手。 樣品的采集和儲(chǔ)存 細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm 離心 20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存于 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融。 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作避免細(xì)胞刺激，4000rpm 離心 20min 分離血清，保存于 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融。 血漿：用肝素、EDTA 或檸檬酸鈉抗凝，4000rpm 離心 20 分鐘取上清，保存于 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融。 組織：用預(yù)冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 沖洗組織，去殘留血液，稱(chēng)重剪碎。按 1 : 9（可調(diào)整）體積比與 PBS（含蛋白酶抑制劑）在冰上研磨，可超聲破碎或反復(fù)凍融，5000×g 離心 5 - 10 分鐘取上清檢測(cè)。 樣本在 2 - 8℃可儲(chǔ)存 72h，或在 - 20℃儲(chǔ)存 6 個(gè)月。若樣本收集后未一次檢測(cè)完，需按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)室溫解凍并確保均勻充分。 檢驗(yàn)方法操作程序 將試劑移至室溫平衡兩小時(shí)，按當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量，用蒸餾水 1：20 稀釋濃縮洗滌液，混勻備用。 取出預(yù)包被板，設(shè)空白對(duì)照孔（不加液體），每個(gè)校準(zhǔn)品設(shè) 2 孔，每孔加對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)品 15μl，其余檢測(cè)孔加待測(cè)血清或質(zhì)控品 15μl。 除空白孔外，所有孔加 Asaay Diluent 100μl，混勻，貼封板膜，37℃溫育 60 分鐘。 洗板： 手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，注滿(mǎn)洗滌液，靜置 10 秒甩干，重復(fù) 3 次后拍干。 洗板機(jī)洗板：選擇洗滌 3 次程序洗板后拍干。 每孔加 SA - HRP 100μl（空白對(duì)照孔除外），混勻，貼封板膜，37℃溫育 30 分鐘。 重復(fù)第 4 步洗板操作。 每孔加 TMB 100μl，振蕩混勻，37℃避光顯色 15 分鐘，每孔加終止液 100μl。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下，先以空白對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn)，再測(cè)定各孔光密度值（OD 值）。 結(jié)果計(jì)算 檢測(cè)完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD 值）為橫坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件采用四參數(shù) Logistic 曲線(xiàn)擬合（4 - pl）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。通過(guò)樣本的吸光度（OD 值），利用方程計(jì)算樣品濃度值。若樣品被稀釋?zhuān)瑴y(cè)得的濃度值需乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品最終濃度。 試劑盒性能指標(biāo) 物理性能：液體組分應(yīng)澄清，無(wú)沉淀或絮狀物，所有組分包裝無(wú)破損，各組分裝量不少于要求。 劑量反應(yīng)曲線(xiàn)線(xiàn)性：用四參數(shù) Logistic 曲線(xiàn)擬合（4 - pl），劑量 - 反應(yīng)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值不低于 0.9900。 精密度： 批內(nèi)精密度：三組高、中、低濃度樣品在同一板塊內(nèi)進(jìn)行二十次精度評(píng)估，批內(nèi)變異系數(shù) CV% 小于 15%。 批間精密度：三組高、中、低濃度樣品在不同板塊內(nèi)進(jìn)行二十次精度評(píng)估，批間變異系數(shù) CV% 小于 15%。 靈敏度：最低檢出限不高于 0.1pg/mL。 回收率：三組高、中、低濃度樣品在同一板塊內(nèi)進(jìn)行五次回收率評(píng)估，回收率在 85% - 115% 之間。 穩(wěn)定性：2℃ - 8℃保存，有效期 6 個(gè)月。 檢測(cè)范圍：5 pg/mL – 80 pg/mL 。 |
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