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愛吃旺旺碎冰冰新蟲 (小有名氣)
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[求助]
目的基因片段總是裝載不上pMD18-T載體上，求助�。�！ 已有1人參與
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一、用高保真酶、設(shè)計(jì)的引物對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（50μL體系共三管)，電泳后發(fā)現(xiàn)條帶單一且無雜帶 二、PCR產(chǎn)物純化 三、將膠回收的DNA片段加A尾: 1.膠回收提取液與Taq酶預(yù)混物1：1混合，各為25μL（共50μL） 2.72℃退火30min 3.PCR產(chǎn)物純化【純化過程中的第二步：2.估計(jì)PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液的體積，向其中加入等倍體積溶液PC（此步加入30μLPC，實(shí)際上上一步PCR反應(yīng)液為50μL，但誤以為是30μL，所以加了30μL溶液PC與50μLPCR反應(yīng)液混合均勻后就加入吸附柱中了，加完后發(fā)現(xiàn)加錯(cuò)了，又向吸附住中補(bǔ)加了20uL）】 四、將pMD18-T載體與已純化的目的片段相連接： 1.1μLpMD18-T載體、5μL連接緩沖液SolutionⅠ、4μL已純化的PCR產(chǎn)物加入到一個(gè)新的PCR管中混勻 2.將其放入金屬浴連接槽中16℃恒溫過夜，本次連接時(shí)間共計(jì)17h左右 3.將樣品取出冰箱4℃保存。 五、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞（CaCl2轉(zhuǎn)化法）: 1.從-80℃冰箱中取出一管制備好的感受態(tài)細(xì)胞Top10（100μL），立即置于冰水混合物上，將10μL制備好的質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吹打混勻，將混合物置于冰水混合物中靜置30min 2.將其放在42℃水浴鍋中熱激90s 3.將其取出再置于冰水混合物中5min，然后加入1mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)1h。 六、涂平板及培養(yǎng)： 1.制備兩個(gè)氨芐抗性平板：向60mLLB固體培養(yǎng)基（不燙手即可）中按照1：1000的比例加入60μL氨芐抗性（原液濃度100mg/mL），輕晃混勻，倒兩個(gè)平板，靜止凝固 2.先吸取100μL菌液均勻涂布在氨芐抗性平板上，剩余900μL菌液11000rpm離心1min，棄去800μL上清液，剩余100μL菌液重懸，均勻涂布在另一個(gè)氨芐抗性平板上；37℃過夜培養(yǎng)，本次共計(jì)培養(yǎng)20h左右 七、挑菌落及培養(yǎng)：挑取平板上的單菌落（共七個(gè)）分別接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)，由于操作失誤，導(dǎo)致前20h無振蕩培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌液渾濁度較低，又200rpm振蕩培養(yǎng)了4哈，共計(jì)24h 八、菌液PCR：用Taq酶、設(shè)計(jì)的引物、菌液分別作模版進(jìn)行PCR九、電泳：結(jié)果七種陽性菌液都顯示有目的條帶 九、任意選取一瓶菌液吸取1.5mL提取質(zhì)粒：質(zhì)粒小提試劑盒 十、雙酶切驗(yàn)證目的基因片段是否成功裝載上pMD18-T載體上： 1.（20uL體系）質(zhì)粒10u、10xbuffer2u、Pst1 0.5u、Sac1 0.5u、ddH2O7u混合；38攝氏度恒溫培養(yǎng)箱溫育1h10min； 2.電泳：結(jié)果顯示無條帶 這是我用這種方法（試劑的用量、步驟都一樣）將目的片段裝載到T載體的第三次實(shí)驗(yàn)了，前兩次用的引物不是設(shè)計(jì)的引物，而是從文獻(xiàn)中篩選到的引物，目的是想通過裝載T載體上，測(cè)序出目的片段兩端的未知序列，但通過測(cè)序結(jié)果都顯示空載，都沒有成功裝載了，后面通過全基因比對(duì)出了目的片段的兩端序列，即從全基因中找出了目的基因的完整序列，之后又通過軟件重新設(shè)計(jì)引物（可以擴(kuò)增出完整目的片段），然后就做了上述步驟，只不過沒有測(cè)序，而是通過雙酶切檢驗(yàn)是否成功裝載到T載體上，還是沒有裝載上。 拜托大佬請(qǐng)教一下幾個(gè)問題： 1.做了這三次實(shí)驗(yàn)最后菌液PCR電泳后都顯示有目的條帶，前兩次有一次還做了質(zhì)粒PCR電泳后也顯示有條帶啊，但是就是進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序顯示空載，包括這次雙酶切電電泳后顯示無條帶，我想知道這是哪里出問題了？電泳驗(yàn)證都顯示有條帶，但最后進(jìn)一步驗(yàn)證還是空載，那電泳顯示有條帶是咋回事？難道電泳這么不靠譜嗎？難道以后我都要再測(cè)序或者雙酶切進(jìn)一步驗(yàn)證嗎？ 2.哪些具體步驟可能導(dǎo)致我一直裝載不上T載體？ 3.我該如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)讓目的片段成功裝載到T載體上呢？ 4.以上步驟所有用到的酶，我都是從冰箱里拿出來，也沒有放在冰上加，直接放在離心管架上加的，這會(huì)對(duì)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響嗎？ |
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2樓2024-12-06 16:34:21
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愛吃旺旺碎冰冰3樓2024-12-06 16:36:09
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1.一般情況下目的基因連接T載體很容易成功的；2.做菌液PCR，用擴(kuò)增目的基因的引物擴(kuò)增完，產(chǎn)物電泳檢測(cè)，挑選陽性菌液送sanger測(cè)序，一般沒問題；3.你的菌液PCR是假陽性，有可能是你沒連接上T載體，也有可能是你重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞有問題； 發(fā)自小木蟲手機(jī)客戶端 |
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4樓2024-12-06 18:18:44
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10樓2025-01-26 10:16:56
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