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masterHT鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
常見(jiàn)重組蛋白中核酸殘留去除問(wèn)題 已有1人參與
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最近接手過(guò)幾個(gè)項(xiàng)目都是要求將產(chǎn)品中核酸殘留水平控制在一個(gè)極低水平。眾所周知常見(jiàn)核酸在pH中性環(huán)境下帶負(fù)電荷結(jié)合陰離子層析填料，常用強(qiáng)陰離子及肝素進(jìn)行分離純化。 在此想討論的是核酸被蛋白包裹在三維結(jié)構(gòu)中時(shí)的核酸去除方法。由于核酸被包裹在蛋白中導(dǎo)致我們?cè)诤怂崮z中無(wú)法觀測(cè)到核酸殘留，這時(shí)候可以在跑核酸膠前往樣品中添加蛋白變性loading，通過(guò)SDS打開(kāi)蛋白折疊結(jié)構(gòu)釋放核酸就可以通過(guò)核酸膠清晰看到核酸殘留條帶。 剛開(kāi)始接觸到這個(gè)項(xiàng)目確實(shí)很頭大，畢竟核酸與蛋白結(jié)合是一種物理鑲嵌，基本上在各種填料上結(jié)合后洗脫時(shí)蛋白與核酸都是同梯度下被連帶洗脫出來(lái)。后來(lái)是通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀打開(kāi)核酸與蛋白的鑲嵌后采用核酸酶對(duì)核酸進(jìn)行降解后回掛得到核酸殘留極低的樣品。但是該方法并不適合所有蛋白，最近接手的另外一個(gè)項(xiàng)目想通過(guò)同樣方式可惜不行，核酸依舊被牢牢包裹在蛋白中，過(guò)夜用核酸酶處理蛋白依舊還有核酸殘留。 看別的論壇里面說(shuō)羅氏的專利有些過(guò)使用1.5M氯化鈉處理蛋白可以分離核酸與蛋白，我就試了1M，2M，3M梯度。確實(shí)在其中一個(gè)蛋白有點(diǎn)效果，在不添加蛋白變性loading情況下能看到些許釋放出來(lái)的核酸條帶，可能時(shí)間短了（室溫4h）。但這個(gè)方法在我這個(gè)項(xiàng)目中并不太現(xiàn)實(shí)。我這個(gè)蛋白疏水性有點(diǎn)太弱了，70%硫酸銨飽和度下才能沉淀目的蛋白，所以相對(duì)來(lái)說(shuō)比較穩(wěn)定�？赡苁窃撛�?qū)е聼o(wú)法想之前那個(gè)項(xiàng)目一樣去除核酸。 也想看有沒(méi)有大牛有過(guò)這方面的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，大家一起交流下心得  |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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用我們的固定化核酸酶去除。關(guān)鍵是選一款好用的磁珠，譬如國(guó)外promega的magnesil和國(guó)內(nèi)purimag的prepsil都是不錯(cuò)的硅磁珠。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
3樓2024-11-22 22:24:50
masterHT
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2樓2024-11-14 16:17:11
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4樓2024-11-28 14:55:03
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