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masterHT鐵蟲 (初入文壇)
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[交流]
常見重組蛋白中核酸殘留去除問題 已有1人參與
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最近接手過幾個項目都是要求將產(chǎn)品中核酸殘留水平控制在一個極低水平。眾所周知常見核酸在pH中性環(huán)境下帶負電荷結(jié)合陰離子層析填料，常用強陰離子及肝素進行分離純化。 在此想討論的是核酸被蛋白包裹在三維結(jié)構(gòu)中時的核酸去除方法。由于核酸被包裹在蛋白中導(dǎo)致我們在核酸膠中無法觀測到核酸殘留，這時候可以在跑核酸膠前往樣品中添加蛋白變性loading，通過SDS打開蛋白折疊結(jié)構(gòu)釋放核酸就可以通過核酸膠清晰看到核酸殘留條帶。 剛開始接觸到這個項目確實很頭大，畢竟核酸與蛋白結(jié)合是一種物理鑲嵌，基本上在各種填料上結(jié)合后洗脫時蛋白與核酸都是同梯度下被連帶洗脫出來。后來是通過硫酸銨分級沉淀打開核酸與蛋白的鑲嵌后采用核酸酶對核酸進行降解后回掛得到核酸殘留極低的樣品。但是該方法并不適合所有蛋白，最近接手的另外一個項目想通過同樣方式可惜不行，核酸依舊被牢牢包裹在蛋白中，過夜用核酸酶處理蛋白依舊還有核酸殘留。 看別的論壇里面說羅氏的專利有些過使用1.5M氯化鈉處理蛋白可以分離核酸與蛋白，我就試了1M，2M，3M梯度。確實在其中一個蛋白有點效果，在不添加蛋白變性loading情況下能看到些許釋放出來的核酸條帶，可能時間短了（室溫4h）。但這個方法在我這個項目中并不太現(xiàn)實。我這個蛋白疏水性有點太弱了，70%硫酸銨飽和度下才能沉淀目的蛋白，所以相對來說比較穩(wěn)定。可能是該原因?qū)е聼o法想之前那個項目一樣去除核酸。 也想看有沒有大牛有過這方面的項目經(jīng)驗，大家一起交流下心得  |
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2樓2024-11-14 16:17:11
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用我們的固定化核酸酶去除。關(guān)鍵是選一款好用的磁珠，譬如國外promega的magnesil和國內(nèi)purimag的prepsil都是不錯的硅磁珠。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2024-11-22 22:24:50
masterHT
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4樓2024-11-28 14:55:03
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