 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1187 | 回復(fù): 1 | |||
MDL實(shí)驗(yàn)室新蟲 (初入文壇)
|
[交流]
干貨分享 | 無縫克隆常見問題解答 已有1人參與
|
|
分子克隆實(shí)驗(yàn)——無縫克隆 今天和大家講講無縫克隆常見的問題以及解決方法。 1.平板上很少或者沒有克隆菌落 建議使用試劑盒附帶的陽性對(duì)照，可排除試劑盒本身的影響。進(jìn)一步判定，主要有以下可能的情況和建議：01載體制備線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。02插入片段制備1、引物設(shè)計(jì)不正確：同源臂15~25nt（不計(jì)算酶切位點(diǎn)）,CG含量40~60%。 2、線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。若線性化載體與插入片段已經(jīng)過純化，且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶單一或無 Smear 殘留時(shí)，可使用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行濃度測(cè)定，當(dāng) A260/A280 在 1.8~2.0 之間時(shí)，濃度值可信，未純化的DNA使用體積不能超過反應(yīng)體積的1/5。03無縫克隆線性化載體和插入片段的投入量不足或過量，比例不佳：按照明書推薦的最適用量和比例配制反應(yīng)體系。04轉(zhuǎn)化感受態(tài)效率低：感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/ug，重組產(chǎn)物的體積不能超過感受態(tài)的1/10。 2.多數(shù)克隆不含插入片段（假陽性） 主要有以下可能的情況和建議：01載體制備：✿載體線性化不徹底：設(shè)置陰性對(duì)照檢測(cè)載體是否線性化完全。✿相同抗性的質(zhì)粒污染：以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段 PCR 擴(kuò)增時(shí)，使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。02插入片段制備：插入片段的制備產(chǎn)物不特異：優(yōu)化PCR體系（Tm,模板投入量，循環(huán)數(shù)等），提高特異性；膠回收PCR產(chǎn)物。03克隆篩選：平板抗性不足：確保使用正確的抗生素，并使用新鮮制備的抗生素平板。 3.菌落PCR無條帶 主要有以下可能的情況和建議：01載體制備：重組失�。喝糁挥锌召|(zhì)粒條帶，表明重組失敗，載體線性化不徹底，優(yōu)化酶切體系或PCR體系。02插入片段制備：引物不正確，使用通用引物或者至少一條通用引物進(jìn)行菌檢。03克隆篩選：PCR體系或者程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，優(yōu)化PCR體系和程序（Tm，模板投入量，循環(huán)數(shù)等）；進(jìn)行提質(zhì)粒做模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證或者酶切驗(yàn)證。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
322,求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
0857求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
295求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
一志愿中南大學(xué)理學(xué)化學(xué)
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
085600 材料與化工 298
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
281求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
0856材料與化工，270求調(diào)劑
已經(jīng)有14人回復(fù)
-
331求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
strongFv
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 31.3
- 帖子: 29
- 在線: 45.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 24591529
- 注冊(cè): 2020-11-17
- 專業(yè): 發(fā)育生物學(xué)
2樓2024-09-06 10:23:28
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 MDL實(shí)驗(yàn)室 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考博] 26超級(jí)電容器申博 +4 | dhdjdjend 2026-02-25 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考博] 26申博-目前4篇SCI一作 +3 | chen_2024 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601 材料305分求助 +3 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
[考研] 一志愿西工大材料學(xué)，英一數(shù)二總分321分，求調(diào)劑。 +3 | zz05zz 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料328求調(diào)劑 +5 | 一個(gè)蘿卜02 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 請(qǐng)問大家，研究風(fēng)險(xiǎn)與應(yīng)對(duì)措施那里， 大家都怎么寫呢 ？ +3 | cauasen 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 江蘇省農(nóng)科院招調(diào)劑1名 +5 | Qwertyuop 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 成績276，專業(yè)代碼0856求調(diào)劑 +7 | 小陳朵 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +10 | 簡單點(diǎn)0 2026-03-02 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 化工270求調(diào)劑 +10 | 什么名字qwq 2026-03-02 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +3 | 滿天星11_22 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運(yùn)連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +5 | 13853210211 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑 +10 | 劉夢(mèng)微 2026-02-28 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 265分求調(diào)劑不調(diào)專業(yè)和學(xué)校有行學(xué)上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +3 | dua1 2026-03-01 | 4/200 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 成果系統(tǒng)訪問量大，請(qǐng)一小時(shí)后再嘗試。---NSFC啥時(shí)候好哦，已經(jīng)兩天這樣了 +4 | NSFC2026我來了 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 291分工科求調(diào)劑 +9 | science餓餓 2026-03-01 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 295復(fù)試調(diào)劑 +3 | 簡木ChuFront 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[高分子] 求環(huán)氧樹脂研發(fā)1名 +3 | 孫xc 2026-02-25 | 11/550 |
|