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干貨分享 | 無縫克隆常見問題解答 已有1人參與
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分子克隆實驗——無縫克隆 今天和大家講講無縫克隆常見的問題以及解決方法。 1.平板上很少或者沒有克隆菌落 建議使用試劑盒附帶的陽性對照，可排除試劑盒本身的影響。進(jìn)一步判定，主要有以下可能的情況和建議：01載體制備線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。02插入片段制備1、引物設(shè)計不正確：同源臂15~25nt（不計算酶切位點(diǎn)）,CG含量40~60%。 2、線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。若線性化載體與插入片段已經(jīng)過純化，且經(jīng)電泳檢測條帶單一或無 Smear 殘留時，可使用超微量核酸蛋白檢測儀進(jìn)行濃度測定，當(dāng) A260/A280 在 1.8~2.0 之間時，濃度值可信，未純化的DNA使用體積不能超過反應(yīng)體積的1/5。03無縫克隆線性化載體和插入片段的投入量不足或過量，比例不佳：按照明書推薦的最適用量和比例配制反應(yīng)體系。04轉(zhuǎn)化感受態(tài)效率低：感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/ug，重組產(chǎn)物的體積不能超過感受態(tài)的1/10。 2.多數(shù)克隆不含插入片段（假陽性） 主要有以下可能的情況和建議：01載體制備：✿載體線性化不徹底：設(shè)置陰性對照檢測載體是否線性化完全。✿相同抗性的質(zhì)粒污染：以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段 PCR 擴(kuò)增時，使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。02插入片段制備：插入片段的制備產(chǎn)物不特異：優(yōu)化PCR體系（Tm,模板投入量，循環(huán)數(shù)等），提高特異性；膠回收PCR產(chǎn)物。03克隆篩選：平板抗性不足：確保使用正確的抗生素，并使用新鮮制備的抗生素平板。 3.菌落PCR無條帶 主要有以下可能的情況和建議：01載體制備：重組失�。喝糁挥锌召|(zhì)粒條帶，表明重組失敗，載體線性化不徹底，優(yōu)化酶切體系或PCR體系。02插入片段制備：引物不正確，使用通用引物或者至少一條通用引物進(jìn)行菌檢。03克隆篩選：PCR體系或者程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，優(yōu)化PCR體系和程序（Tm，模板投入量，循環(huán)數(shù)等）；進(jìn)行提質(zhì)粒做模板，進(jìn)行PCR驗證或者酶切驗證。 |
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