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Sh畢合生物

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專業(yè): 高分子合成化學

[交流] 快速了解熒光定量PCR與數(shù)字PCR區(qū)別

提起 PCR，在生物及其相關行業(yè)內可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應用之廣可見一斑。

　　 1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細胞內的 DNA 復制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。耐熱 DNA 聚合酶的應用使得 PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。

　　根據 PCR 的發(fā)展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。

提起 PCR，在生物及其相關行業(yè)內可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應用之廣可見一斑。

　　 1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細胞內的 DNA 復制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。耐熱 DNA 聚合酶的應用使得 PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。

　　根據 PCR 的發(fā)展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。

　　基本原理

　　 PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外 DNA 擴增技術，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNA 片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。

　　儀器與耗材

　　基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。

　　結果檢測

　　 PCR 反應擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。

　　應用

　　 PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

　　實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）

　　基本原理

　　 qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累，從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。

　　根據 PCR 定量原理公式可推導出，模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數(shù)量呈對應關系，只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。

　　 Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現(xiàn)性。

　　模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

　　基本原理

　　 PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外 DNA 擴增技術，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNA 片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。

　　儀器與耗材

　　基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。

　　結果檢測

　　 PCR 反應擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。

　　應用

　　 PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

　　實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）

　　基本原理

　　 qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累，從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。

　　根據 PCR 定量原理公式可推導出，模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數(shù)量呈對應關系，只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。

　　 Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現(xiàn)性。

　　模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

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1樓 2024-06-19 18:01:47

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