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快速了解熒光定量PCR與數(shù)字PCR區(qū)別
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提起 PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應(yīng)用之廣可見一斑。 1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。 根據(jù) PCR 的發(fā)展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。 提起 PCR，在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應(yīng)用之廣可見一斑。 1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），實現(xiàn)了在試管中模擬細胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。 根據(jù) PCR 的發(fā)展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。 基本原理 PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）是一種體外 DNA 擴增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。 儀器與耗材 基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。 結(jié)果檢測 PCR 反應(yīng)擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。 應(yīng)用 PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。 實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 基本原理 qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。 根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品繪制標準曲線，根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系， 只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進行 96 次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現(xiàn)性。 模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。 基本原理 PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）是一種體外 DNA 擴增技術(shù)，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。 儀器與耗材 基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環(huán)的目的，各有其優(yōu)缺點，在此不再贅述。 結(jié)果檢測 PCR 反應(yīng)擴增出很高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。 應(yīng)用 PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。 實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 基本原理 qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。 根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出， 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品繪制標準曲線，根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系， 只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進行 96 次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現(xiàn)性。 模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。 畢合生物（www.bihebio.com）提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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