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MDL實(shí)驗(yàn)室新蟲(chóng) (初入文壇)
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實(shí)驗(yàn)干貨 | 細(xì)胞復(fù)蘇tips
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平時(shí)研究用的細(xì)胞，有需要冷凍保存。冷凍的過(guò)程稱為凍存，和凍存對(duì)應(yīng)的過(guò)程，稱為復(fù)蘇，通俗地說(shuō)就是把凍上的細(xì)胞化開(kāi)。 細(xì)胞復(fù)蘇是一簡(jiǎn)單的試驗(yàn)操作，但操作中有許多需要注意的事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小問(wèn)題，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞狀態(tài)保持良好。 下面小編就和大家分享細(xì)胞復(fù)蘇的“避坑指南”。 細(xì)胞復(fù)蘇的基本原則 快速融化：細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。 在復(fù)蘇時(shí)，需要快速升溫，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)外還來(lái)不及形成較大的冰晶，也不會(huì)使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中，從而避免細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率。 避免溫度變化：在復(fù)蘇過(guò)程中，應(yīng)盡量避免溫度的劇烈變化，以免對(duì)細(xì)胞造成額外的壓力。 圖片 細(xì)胞復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng) （1）提前從液氮罐中取出需要解凍的凍存管，放于-80 ℃冰箱（為了避免解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，溫差過(guò)大導(dǎo)致的爆炸），讓凍存管中的液氮揮發(fā)。 注意：從液氮中凍存細(xì)胞時(shí)，要佩戴護(hù)目鏡和防凍手套，謹(jǐn)防凍傷及凍存管爆炸！ （2）凍存管取出后，以最快速度放入37℃恒溫水浴鍋中。如果儲(chǔ)存裝置和解凍裝置相隔較遠(yuǎn)，可使用裝有干冰的隔熱容器臨時(shí)保存和運(yùn)送細(xì)胞。 細(xì)胞放入水浴中復(fù)蘇時(shí)，注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時(shí)晃動(dòng)，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以可以避免復(fù)蘇過(guò)程中細(xì)胞液中有冰晶的出現(xiàn)。快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細(xì)胞，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。 另外，凍存管管口不能接觸到水浴鍋里的液體，避免造成污染。水浴鍋中的無(wú)菌水也要定期更換。 什么時(shí)候停止解凍？ 通常建議凍存管融化至只剩約2毫米直徑的冰晶時(shí)，即可停止水浴，繼續(xù)晃動(dòng)至冰晶融化。此時(shí)復(fù)蘇的時(shí)間剛好，避免復(fù)蘇過(guò)頭。（升溫至室溫或更高溫度會(huì)增加冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，這會(huì)極大影響細(xì)胞活力。） （3）完全融化后，馬上擦干并用75％酒精擦拭冷凍管外部進(jìn)行消毒。然后在無(wú)菌環(huán)境下，用移液管吸取5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基加入15mL無(wú)菌離心管中，再吸取凍存管里的細(xì)胞懸液加入離心管中。 注意： ◆ 解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細(xì)胞毒性。 ◆ 此時(shí)細(xì)胞比較脆弱，細(xì)胞膜表面還未完全恢復(fù)，劇烈的吹打會(huì)造成細(xì)胞活率下降。因此，需要以輕柔的方式稀釋細(xì)胞凍存懸液。輕柔顛倒混勻，充分稀釋凍存液，有條件可以靜置1分鐘，使細(xì)胞恢復(fù)滲透壓，再進(jìn)行下一步操作。 （4）根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，吸掉上清液，加入2-3mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打均勻，保證細(xì)胞完全重懸。 注意：離心的目的有兩個(gè)，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程。但對(duì)一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)速不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)速過(guò)高活細(xì)胞受壓過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致死亡。推薦250 g離心4 min。 （5）吹打好后，用完全培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，然后將重懸的細(xì)胞全部移入新的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中搖晃均勻。 （6）最后放入37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞貼壁后或 24 h 后，更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。若細(xì)胞密度較高，及時(shí)傳代。 注意：細(xì)胞復(fù)蘇的操作在4℃冰盒中進(jìn)行，以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性。 圖片 （來(lái)源于互聯(lián)網(wǎng)） 常見(jiàn)的問(wèn)題 （1）細(xì)胞復(fù)蘇后，細(xì)胞數(shù)量很少 可能得原因：細(xì)胞凍存前活細(xì)胞少，狀態(tài)不佳；細(xì)胞解凍速度過(guò)慢；細(xì)胞凍存懸液在常溫下時(shí)間太久；未充分稀釋凍存液；離心速度不恰當(dāng)。 對(duì)策： ◆ 確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好，活細(xì)胞比例高。 ◆ 加快解凍速度，盡量減少在常溫下的放置時(shí)間。 ◆ 確保凍存液充分稀釋，避免對(duì)細(xì)胞造成損傷。 ◆ 調(diào)整離心速度，找到最適合細(xì)胞的離心條件。 （2）細(xì)胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁 對(duì)策： ◆ 檢查緩凍快融操作是否規(guī)范，避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的損傷。 ◆ 確認(rèn)凍存前細(xì)胞的密度和活率是否適宜。 ◆ 控制好消化時(shí)間，避免過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁能力下降。 （3）細(xì)胞貼壁了，卻長(zhǎng)不起來(lái) 對(duì)策： ◆ 調(diào)整細(xì)胞密度，嘗試將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)器皿中，促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。 ◆ 給予細(xì)胞足夠的時(shí)間來(lái)適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，有些細(xì)胞復(fù)蘇后需要一段時(shí)間才能開(kāi)始生長(zhǎng)。 ◆ 確保凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好，避免凍存前細(xì)胞已處于凋亡狀態(tài)。 此外，還需注意培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌操作，定期檢查培養(yǎng)基的成分和pH值，以及確保足夠的營(yíng)養(yǎng)供給和適宜的氣體環(huán)境（如CO2濃度）。在處理細(xì)胞時(shí)，溫和操作，避免造成機(jī)械損傷。 細(xì)胞培養(yǎng)是一門(mén)實(shí)踐性很強(qiáng)的技術(shù)，需要在實(shí)踐中不斷學(xué)習(xí)和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，希望這些建議對(duì)您有所幫助。 |
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