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實驗干貨 | 細胞復(fù)蘇tips
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平時研究用的細胞，有需要冷凍保存。冷凍的過程稱為凍存，和凍存對應(yīng)的過程，稱為復(fù)蘇，通俗地說就是把凍上的細胞化開。 細胞復(fù)蘇是一簡單的試驗操作，但操作中有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小問題，才能使復(fù)蘇后的細胞狀態(tài)保持良好。 下面小編就和大家分享細胞復(fù)蘇的“避坑指南”。 細胞復(fù)蘇的基本原則 快速融化：細胞復(fù)蘇過程升溫要快，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶，影響細胞存活。 在復(fù)蘇時，需要快速升溫，在 1-2 min 內(nèi)融化并稀釋，這時細胞內(nèi)外還來不及形成較大的冰晶，也不會使細胞長時間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中，從而避免細胞損傷，提高細胞存活率。 避免溫度變化：在復(fù)蘇過程中，應(yīng)盡量避免溫度的劇烈變化，以免對細胞造成額外的壓力。 圖片 細胞復(fù)蘇的實驗步驟及注意事項 （1）提前從液氮罐中取出需要解凍的凍存管，放于-80 ℃冰箱（為了避免解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，溫差過大導(dǎo)致的爆炸），讓凍存管中的液氮揮發(fā)。 注意：從液氮中凍存細胞時，要佩戴護目鏡和防凍手套，謹防凍傷及凍存管爆炸！ （2）凍存管取出后，以最快速度放入37℃恒溫水浴鍋中。如果儲存裝置和解凍裝置相隔較遠，可使用裝有干冰的隔熱容器臨時保存和運送細胞。 細胞放入水浴中復(fù)蘇時，注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以可以避免復(fù)蘇過程中細胞液中有冰晶的出現(xiàn)。快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細胞，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。 另外，凍存管管口不能接觸到水浴鍋里的液體，避免造成污染。水浴鍋中的無菌水也要定期更換。 什么時候停止解凍？ 通常建議凍存管融化至只剩約2毫米直徑的冰晶時，即可停止水浴，繼續(xù)晃動至冰晶融化。此時復(fù)蘇的時間剛好，避免復(fù)蘇過頭。（升溫至室溫或更高溫度會增加冷凍保護劑的細胞毒性，這會極大影響細胞活力。） （3）完全融化后，馬上擦干并用75％酒精擦拭冷凍管外部進行消毒。然后在無菌環(huán)境下，用移液管吸取5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基加入15mL無菌離心管中，再吸取凍存管里的細胞懸液加入離心管中。 注意： ◆ 解凍后應(yīng)盡快稀釋，以減少 DMSO 的細胞毒性。 ◆ 此時細胞比較脆弱，細胞膜表面還未完全恢復(fù)，劇烈的吹打會造成細胞活率下降。因此，需要以輕柔的方式稀釋細胞凍存懸液。輕柔顛倒混勻，充分稀釋凍存液，有條件可以靜置1分鐘，使細胞恢復(fù)滲透壓，再進行下一步操作。 （4）根據(jù)細胞類型選擇合適的離心速度，低速離心5min，吸掉上清液，加入2-3mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打均勻，保證細胞完全重懸。 注意：離心的目的有兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程。但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)速不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)速過高活細胞受壓過大，會導(dǎo)致死亡。推薦250 g離心4 min。 （5）吹打好后，用完全培養(yǎng)基適當稀釋，然后將重懸的細胞全部移入新的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中搖晃均勻。 （6）最后放入37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱，依據(jù)細胞狀態(tài)，在細胞貼壁后或 24 h 后，更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。 注意：細胞復(fù)蘇的操作在4℃冰盒中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。 圖片 （來源于互聯(lián)網(wǎng)） 常見的問題 （1）細胞復(fù)蘇后，細胞數(shù)量很少 可能得原因：細胞凍存前活細胞少，狀態(tài)不佳；細胞解凍速度過慢；細胞凍存懸液在常溫下時間太久；未充分稀釋凍存液；離心速度不恰當。 對策： ◆ 確保凍存前細胞狀態(tài)良好，活細胞比例高。 ◆ 加快解凍速度，盡量減少在常溫下的放置時間。 ◆ 確保凍存液充分稀釋，避免對細胞造成損傷。 ◆ 調(diào)整離心速度，找到最適合細胞的離心條件。 （2）細胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁 對策： ◆ 檢查緩凍快融操作是否規(guī)范，避免操作不當導(dǎo)致的損傷。 ◆ 確認凍存前細胞的密度和活率是否適宜。 ◆ 控制好消化時間，避免過長導(dǎo)致細胞貼壁能力下降。 （3）細胞貼壁了，卻長不起來 對策： ◆ 調(diào)整細胞密度，嘗試將細胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)器皿中，促進細胞間的相互作用。 ◆ 給予細胞足夠的時間來適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，有些細胞復(fù)蘇后需要一段時間才能開始生長。 ◆ 確保凍存前細胞狀態(tài)良好，避免凍存前細胞已處于凋亡狀態(tài)。 此外，還需注意培養(yǎng)環(huán)境的無菌操作，定期檢查培養(yǎng)基的成分和pH值，以及確保足夠的營養(yǎng)供給和適宜的氣體環(huán)境（如CO2濃度）。在處理細胞時，溫和操作，避免造成機械損傷。 細胞培養(yǎng)是一門實踐性很強的技術(shù)，需要在實踐中不斷學(xué)習(xí)和總結(jié)經(jīng)驗，希望這些建議對您有所幫助。 |
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