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肺氣腫動物模型的建立
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實(shí)驗(yàn)動物的選擇 人們對造成肺氣腫的病因以及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識不斷加深，其動物模型的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方法也逐漸完善。但目前的問題是仍然不能夠復(fù)制出與人類肺氣腫病變特征完全相似的動物模型，也不能完全模仿人類病變的過程。 常用于研究肺氣腫的動物模型有鼠類（小鼠、地鼠、大鼠、豚鼠）、比格犬、小型豬、兔到靈長類的猴。鼠類最適合用于制作單純的肺氣腫模型，鼠類基因與人類基因相近，因其飼養(yǎng)方便，繁殖速度快，飼養(yǎng)費(fèi)用低，研究時(shí)間周期短等優(yōu)點(diǎn)；小型豬的肺組織與人類較為相似，靈長類的動物肺組織模型更能接近與人類，但是選擇動物模型要充分考慮可行性、易操作性、經(jīng)濟(jì)性的角度，選擇合適的動物，對于實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行具有重要的影響。在對動物進(jìn)行氣管插管時(shí)，相對于大鼠和豚鼠，小型豬的氣管比較粗，利于插管。 肺氣腫動物模型的制備 01 ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫模型 根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，大約９０％的ＣＯＰＤ患者是吸煙者。吸煙是肺氣腫的最重要危險(xiǎn)因素之一。長期接觸CＳ的動物可能導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)，其主要是由巨噬細(xì)胞刺激引起的，肺組織病理表現(xiàn)為支氣管腔變窄，支氣管軟骨組織受損，導(dǎo)致肺泡破裂和（或）融合以及肺氣腫的形成，這類似于人類對吸煙產(chǎn)生的反應(yīng)。ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫可以盡可能模擬人類肺氣腫的發(fā)病機(jī)理，為人類肺氣腫的基礎(chǔ)和臨床研究提供基礎(chǔ)。ＣＳ暴露方法因其成本低、操作簡單、成功率高而被廣大研究者接受，并且可以消除客觀環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)差異。肺氣腫動物模型的ＣＳ暴露時(shí)間長短由于香煙種類不同，暴露方式、持續(xù)時(shí)間和頻率不同，煙氣密度不同，動物的物種和年齡不同而有所不同。 部分（僅鼻子或頭部）暴露法： C５７ＢＬ／６Ｊ小鼠通過鼻吸入ＣＳ，２次／ｄ，２支香煙／次，１０支噴霧劑／香 煙，５ｄ／周。暴露４個月后，小鼠肺組織病理結(jié)果表明肺泡隨著吸煙時(shí)間的增加而增大。同時(shí)，吸煙小鼠肺組織中的Ｂ淋巴細(xì)胞增加，與人類肺氣腫相似。 全身暴露法： 將實(shí)驗(yàn)動物作為一個整體放置在吸煙盒（裝滿煙的盒子）中。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小 鼠 暴 露 于 ＣＳ中，每天吸煙３次，３支香煙／次。８周后，觀察到肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化，并伴有肺泡巨噬細(xì)胞增多，細(xì)胞外基質(zhì)變化和 ＭＭＰ－１２表達(dá)增加；或 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠每天吸煙２次，５支香煙／次，每周６天，暴露１２周，觀察小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡腔增大、肺泡間隔變窄等病理變化。 02 香煙煙霧提取物（ＣＳＥ）腹腔注射 誘導(dǎo)的肺氣腫模型 既往研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔內(nèi)注射ＣＳＥ可產(chǎn)生顯著的肺氣腫，假設(shè)ＣＳＥ可以作為抗原，觸發(fā)免疫反應(yīng)引起肺氣腫樣改變，僅用了６周就成功建立肺氣腫模型。此外，有研究指出，腹膜內(nèi)注射 ＣＳＥ 構(gòu)建肺氣腫小鼠模型，建模結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行肺功能檢測、收集血液，支氣管肺泡灌洗液和肺組織形態(tài)學(xué)檢測。結(jié)果表明，腹膜內(nèi)注射 ＣＳＥ 可導(dǎo)致肺功能下降、肺泡間隙增大、肺泡壁破壞、肺組織細(xì)胞凋亡、慢性肺部炎癥、氧化應(yīng)激水平增加等。這種建模方法的有效性與ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫動物模型有效性相當(dāng)，相較于傳統(tǒng)的 ＣＳ暴露建模，腹腔注射 ＣＳＥ建模明顯縮短了建模周期。 在 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ或者 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔注射 ＣＳＥ（ＣＳＥ制 備：５支香煙溶 于１０ｍｌ磷酸鹽緩沖液里，經(jīng)濾嘴過濾后使用，每次注射前現(xiàn)配現(xiàn)用），建模為期４周。模型組在第１天、第１１天、第２２天進(jìn)行ＣＳＥ腹腔注射，對照組則注射生理鹽水或磷酸鹽緩沖液；第２９天，建模結(jié)束，根據(jù)研究目的對小鼠進(jìn)行相應(yīng)的處理及收集樣本。 03 彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫模型 氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶破壞了肺組織中蛋白酶－抗蛋白酶之間的平衡，不僅破壞了保護(hù)肺組織免受損傷的主要因素，而且還產(chǎn)生了大量的炎癥因子，加速了肺泡壁的破裂與融合，從而誘發(fā)肺氣腫。常用的彈性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶（PPE）等。用彈性蛋白酶構(gòu)建肺氣腫動物模型的方法具有操作簡單和建模周期較短等優(yōu)點(diǎn)。因此，直接氣管內(nèi)滴入彈性蛋白酶是誘導(dǎo)肺氣腫動物模型的常見有效方法之一。 木瓜蛋白酶是一種來自植物的蛋白水解酶，是最早用于誘導(dǎo)肺氣腫模型的彈性蛋白酶。２ｍｇ／ｋｇ木瓜蛋白酶溶液一次性經(jīng)氣管滴入建立穩(wěn)定肺氣腫模型，為期１周。 ＰＰＥ不僅可以充當(dāng)?shù)鞍酌竵砥茐牡鞍酌福沟鞍酌甘Ш猓�可以作為氧化劑來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，在二者共同作用下，動物模型中的肺泡顯著增大。因此，ＰＰＥ 常被用來誘發(fā)肺氣腫。ＰＰＥ誘導(dǎo)途徑主要包括氣管內(nèi)滴注、氣管切開注射、霧化吸入。ＰＰＥ濃度為0.6ＩＵ 左右，為期４～６周。 氣管內(nèi)滴入酶液直接作用于肺部，較靜脈途徑直接且避免了血液成分的干擾；酶液定量準(zhǔn)確，避免了霧化吸入劑量不準(zhǔn)、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)�？傮w來說，蛋白水解酶法制作的模型適應(yīng)性強(qiáng)，能根據(jù)需要在不同時(shí)間接受不同的干預(yù)措施，因此可用于肺氣腫和肺心病的發(fā)病機(jī)制、病理改變、藥物療效觀察及相關(guān)疾病手術(shù)的有關(guān)研究。 04 化學(xué)物質(zhì)刺激誘導(dǎo)的肺氣腫模型 許多化學(xué)物質(zhì)，包括 NO２、脂多糖（LPS）、氯化鉻（CdC12）等都可能引起炎癥和肺氣腫。小鼠長期暴露于 NO２（NO２ 體積分?jǐn)?shù)20*106，每天14ｈ，持續(xù)25ｄ）后，通過促 進(jìn)氧化應(yīng)激可引起小鼠肺氣腫；LPS（１mg/kg的50μｌ無菌生理鹽水溶液稀釋）主要通過刺激嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞引起氣道和肺組織炎癥，釋放出一系列炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素－１（IL-１）等，引發(fā)蛋白酶－蛋白酶失衡，最終發(fā)生肺氣腫。將0.5ｍ10.025％ CdC12溶液一次性滴入小鼠的氣管中可以誘導(dǎo)出肺氣腫的動物模型。 05 與基因相關(guān)誘導(dǎo)的肺氣腫模型 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因敲除誘導(dǎo)的肺氣腫動物模型已被廣泛用于肺氣腫的研究。利用基因靶向和（或）轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為研究不同疾病的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)的主要技術(shù)方法。有研究指出，Ａｂｈｄ２ 基因敲除小鼠由于炎性細(xì)胞因子和蛋白酶基因的過度表達(dá)、巨噬細(xì)胞增多、細(xì)胞凋亡異常，以及缺乏對蛋白酶抑制劑的抵抗力，導(dǎo)致小鼠肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化。并且這些改變與臨床上肺氣腫發(fā)生發(fā)展具有相似之處。血小板源性生長因子－β（ＰＤＧＦ－β）和 ＴＮＦ－α等可能干擾肺泡的正常發(fā)育，且既往研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的過度表達(dá)可能破壞肺泡受損和修復(fù)兩者之間的平衡，導(dǎo)致肺氣腫的形成。 血小板源性生長因子-β( PDGF-β) ，腫瘤壞死因子- α( TNF-α) ，IL -6，IL-11 等均能干擾肺泡組織的正常發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)如果在小鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)入一些相應(yīng)基因使造成其在體內(nèi)過量表達(dá)，在小鼠的生長發(fā)育的過程中，肺泡就會出現(xiàn)發(fā)育障礙，導(dǎo)致肺氣腫的形成。此外，某些基因如果過量的表達(dá)，就會造成肺泡損傷與修復(fù)之間的平衡被打破，而發(fā)生肺氣腫。TNF-α 是一種免疫調(diào)節(jié)因子，由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，具有引發(fā)炎癥細(xì)胞的作用，同時(shí)還具有參與 IL － 6、IL － 8、前列腺素、白三烯等次級炎癥介質(zhì)合成的作用，適量的表達(dá)是保護(hù)機(jī)體反應(yīng)所必需的，但如果過量表達(dá)就會加劇炎癥反應(yīng)。 圖片 對肺氣腫動物模型的評價(jià)和展望 肺氣腫動物模型建立后還需要有相應(yīng)的評估方法來證實(shí)是否造模成功，這涉及各類評估方法及其標(biāo)準(zhǔn)化問題。目前，主要通過肺功能檢測如呼吸阻力、血?dú)夥治鋈鐒用}血氧分壓( PaO2 ) 、肺泡灌洗液如細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、炎癥指標(biāo)如 TGF-β、肺形態(tài)學(xué)與氣道重塑參數(shù)如氣道炎癥病理評分、氧化抗氧化指標(biāo)如核因子相關(guān)因子，基質(zhì)金屬蛋白酶指標(biāo)如 MMP－2 等評價(jià)來確定模型建立成功與否。 從目前的研究來說，尚不能復(fù)制出一種完美的完全符合人類肺氣腫發(fā)病過程及發(fā)病特征的穩(wěn)定性較好的肺氣腫實(shí)驗(yàn)動物模型。但隨著學(xué)者們的不斷深入研究，可供選擇的誘導(dǎo)方法越來越多，因此我們不僅可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枨髞碚T導(dǎo)相對應(yīng)的肺氣腫實(shí)驗(yàn)動物模型，也可以通過多種方法復(fù)制模型來探索其發(fā)病機(jī)制。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不久的將來我們會找到更為合理的肺氣腫動物模型并且能更好的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。 |
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