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肺氣腫動物模型的建立
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實驗動物的選擇 人們對造成肺氣腫的病因以及發(fā)病機制的認識不斷加深，其動物模型的實驗誘導方法也逐漸完善。但目前的問題是仍然不能夠復制出與人類肺氣腫病變特征完全相似的動物模型，也不能完全模仿人類病變的過程。 常用于研究肺氣腫的動物模型有鼠類（小鼠、地鼠、大鼠、豚鼠）、比格犬、小型豬、兔到靈長類的猴。鼠類最適合用于制作單純的肺氣腫模型，鼠類基因與人類基因相近，因其飼養(yǎng)方便，繁殖速度快，飼養(yǎng)費用低，研究時間周期短等優(yōu)點；小型豬的肺組織與人類較為相似，靈長類的動物肺組織模型更能接近與人類，但是選擇動物模型要充分考慮可行性、易操作性、經(jīng)濟性的角度，選擇合適的動物，對于實驗的順利進行具有重要的影響。在對動物進行氣管插管時，相對于大鼠和豚鼠，小型豬的氣管比較粗，利于插管。 肺氣腫動物模型的制備 01 ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫模型 根據(jù)臨床統(tǒng)計，大約９０％的ＣＯＰＤ患者是吸煙者。吸煙是肺氣腫的最重要危險因素之一。長期接觸CＳ的動物可能導致肺部炎癥反應，其主要是由巨噬細胞刺激引起的，肺組織病理表現(xiàn)為支氣管腔變窄，支氣管軟骨組織受損，導致肺泡破裂和（或）融合以及肺氣腫的形成，這類似于人類對吸煙產(chǎn)生的反應。ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫可以盡可能模擬人類肺氣腫的發(fā)病機理，為人類肺氣腫的基礎和臨床研究提供基礎。ＣＳ暴露方法因其成本低、操作簡單、成功率高而被廣大研究者接受，并且可以消除客觀環(huán)境中的實驗差異。肺氣腫動物模型的ＣＳ暴露時間長短由于香煙種類不同，暴露方式、持續(xù)時間和頻率不同，煙氣密度不同，動物的物種和年齡不同而有所不同。 部分（僅鼻子或頭部）暴露法： C５７ＢＬ／６Ｊ小鼠通過鼻吸入ＣＳ，２次／ｄ，２支香煙／次，１０支噴霧劑／香 煙，５ｄ／周。暴露４個月后，小鼠肺組織病理結(jié)果表明肺泡隨著吸煙時間的增加而增大。同時，吸煙小鼠肺組織中的Ｂ淋巴細胞增加，與人類肺氣腫相似。 全身暴露法： 將實驗動物作為一個整體放置在吸煙盒（裝滿煙的盒子）中。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小 鼠 暴 露 于 ＣＳ中，每天吸煙３次，３支香煙／次。８周后，觀察到肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化，并伴有肺泡巨噬細胞增多，細胞外基質(zhì)變化和 ＭＭＰ－１２表達增加；或 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠每天吸煙２次，５支香煙／次，每周６天，暴露１２周，觀察小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡腔增大、肺泡間隔變窄等病理變化。 02 香煙煙霧提取物（ＣＳＥ）腹腔注射 誘導的肺氣腫模型 既往研究者發(fā)現(xiàn)在小鼠腹腔內(nèi)注射ＣＳＥ可產(chǎn)生顯著的肺氣腫，假設ＣＳＥ可以作為抗原，觸發(fā)免疫反應引起肺氣腫樣改變，僅用了６周就成功建立肺氣腫模型。此外，有研究指出，腹膜內(nèi)注射 ＣＳＥ 構(gòu)建肺氣腫小鼠模型，建模結(jié)束后，對小鼠進行肺功能檢測、收集血液，支氣管肺泡灌洗液和肺組織形態(tài)學檢測。結(jié)果表明，腹膜內(nèi)注射 ＣＳＥ 可導致肺功能下降、肺泡間隙增大、肺泡壁破壞、肺組織細胞凋亡、慢性肺部炎癥、氧化應激水平增加等。這種建模方法的有效性與ＣＳ暴露誘發(fā)的肺氣腫動物模型有效性相當，相較于傳統(tǒng)的 ＣＳ暴露建模，腹腔注射 ＣＳＥ建模明顯縮短了建模周期。 在 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ或者 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔注射 ＣＳＥ（ＣＳＥ制 備：５支香煙溶 于１０ｍｌ磷酸鹽緩沖液里，經(jīng)濾嘴過濾后使用，每次注射前現(xiàn)配現(xiàn)用），建模為期４周。模型組在第１天、第１１天、第２２天進行ＣＳＥ腹腔注射，對照組則注射生理鹽水或磷酸鹽緩沖液；第２９天，建模結(jié)束，根據(jù)研究目的對小鼠進行相應的處理及收集樣本。 03 彈性蛋白酶誘導的肺氣腫模型 氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶破壞了肺組織中蛋白酶－抗蛋白酶之間的平衡，不僅破壞了保護肺組織免受損傷的主要因素，而且還產(chǎn)生了大量的炎癥因子，加速了肺泡壁的破裂與融合，從而誘發(fā)肺氣腫。常用的彈性蛋白酶包括：木瓜蛋白酶、豬胰彈性蛋白酶（PPE）等。用彈性蛋白酶構(gòu)建肺氣腫動物模型的方法具有操作簡單和建模周期較短等優(yōu)點。因此，直接氣管內(nèi)滴入彈性蛋白酶是誘導肺氣腫動物模型的常見有效方法之一。 木瓜蛋白酶是一種來自植物的蛋白水解酶，是最早用于誘導肺氣腫模型的彈性蛋白酶。２ｍｇ／ｋｇ木瓜蛋白酶溶液一次性經(jīng)氣管滴入建立穩(wěn)定肺氣腫模型，為期１周。 ＰＰＥ不僅可以充當?shù)鞍酌竵砥茐牡鞍酌福沟鞍酌甘Ш�，還可以作為氧化劑來誘導氧化應激，在二者共同作用下，動物模型中的肺泡顯著增大。因此，ＰＰＥ 常被用來誘發(fā)肺氣腫。ＰＰＥ誘導途徑主要包括氣管內(nèi)滴注、氣管切開注射、霧化吸入。ＰＰＥ濃度為0.6ＩＵ 左右，為期４～６周。 氣管內(nèi)滴入酶液直接作用于肺部，較靜脈途徑直接且避免了血液成分的干擾；酶液定量準確，避免了霧化吸入劑量不準、操作復雜的缺點。總體來說，蛋白水解酶法制作的模型適應性強，能根據(jù)需要在不同時間接受不同的干預措施，因此可用于肺氣腫和肺心病的發(fā)病機制、病理改變、藥物療效觀察及相關疾病手術(shù)的有關研究。 04 化學物質(zhì)刺激誘導的肺氣腫模型 許多化學物質(zhì)，包括 NO２、脂多糖（LPS）、氯化鉻（CdC12）等都可能引起炎癥和肺氣腫。小鼠長期暴露于 NO２（NO２ 體積分數(shù)20*106，每天14ｈ，持續(xù)25ｄ）后，通過促 進氧化應激可引起小鼠肺氣腫；LPS（１mg/kg的50μｌ無菌生理鹽水溶液稀釋）主要通過刺激嗜中性粒細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞引起氣道和肺組織炎癥，釋放出一系列炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細胞介素－１（IL-１）等，引發(fā)蛋白酶－蛋白酶失衡，最終發(fā)生肺氣腫。將0.5ｍ10.025％ CdC12溶液一次性滴入小鼠的氣管中可以誘導出肺氣腫的動物模型。 05 與基因相關誘導的肺氣腫模型 隨著分子生物學的發(fā)展，基因敲除誘導的肺氣腫動物模型已被廣泛用于肺氣腫的研究。利用基因靶向和（或）轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為研究不同疾病的細胞和分子基礎的主要技術(shù)方法。有研究指出，Ａｂｈｄ２ 基因敲除小鼠由于炎性細胞因子和蛋白酶基因的過度表達、巨噬細胞增多、細胞凋亡異常，以及缺乏對蛋白酶抑制劑的抵抗力，導致小鼠肺部出現(xiàn)肺氣腫樣變化。并且這些改變與臨床上肺氣腫發(fā)生發(fā)展具有相似之處。血小板源性生長因子－β（ＰＤＧＦ－β）和 ＴＮＦ－α等可能干擾肺泡的正常發(fā)育，且既往研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的過度表達可能破壞肺泡受損和修復兩者之間的平衡，導致肺氣腫的形成。 血小板源性生長因子-β( PDGF-β) ，腫瘤壞死因子- α( TNF-α) ，IL -6，IL-11 等均能干擾肺泡組織的正常發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)如果在小鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)入一些相應基因使造成其在體內(nèi)過量表達，在小鼠的生長發(fā)育的過程中，肺泡就會出現(xiàn)發(fā)育障礙，導致肺氣腫的形成。此外，某些基因如果過量的表達，就會造成肺泡損傷與修復之間的平衡被打破，而發(fā)生肺氣腫。TNF-α 是一種免疫調(diào)節(jié)因子，由單核細胞和巨噬細胞分泌，具有引發(fā)炎癥細胞的作用，同時還具有參與 IL － 6、IL － 8、前列腺素、白三烯等次級炎癥介質(zhì)合成的作用，適量的表達是保護機體反應所必需的，但如果過量表達就會加劇炎癥反應。 圖片 對肺氣腫動物模型的評價和展望 肺氣腫動物模型建立后還需要有相應的評估方法來證實是否造模成功，這涉及各類評估方法及其標準化問題。目前，主要通過肺功能檢測如呼吸阻力、血氣分析如動脈血氧分壓( PaO2 ) 、肺泡灌洗液如細胞計數(shù)及分類、炎癥指標如 TGF-β、肺形態(tài)學與氣道重塑參數(shù)如氣道炎癥病理評分、氧化抗氧化指標如核因子相關因子，基質(zhì)金屬蛋白酶指標如 MMP－2 等評價來確定模型建立成功與否。 從目前的研究來說，尚不能復制出一種完美的完全符合人類肺氣腫發(fā)病過程及發(fā)病特征的穩(wěn)定性較好的肺氣腫實驗動物模型。但隨著學者們的不斷深入研究，可供選擇的誘導方法越來越多，因此我們不僅可以根據(jù)實驗目的需求來誘導相對應的肺氣腫實驗動物模型，也可以通過多種方法復制模型來探索其發(fā)病機制。相信隨著科學技術(shù)的發(fā)展，不久的將來我們會找到更為合理的肺氣腫動物模型并且能更好的應用于實驗研究。 |
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