 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 907 | 回復(fù): 0 | |||
科研實(shí)驗(yàn)_研實(shí)新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
干貨分享 | 實(shí)驗(yàn)樣本保存的6條吐血經(jīng)驗(yàn)
|
|
一、實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)來(lái)源于哪里？ 科研項(xiàng)目成功的關(guān)鍵是什么？合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作？等這些都是必不可少的因素之一。但是，還有一項(xiàng)目是容易被忽視-樣本，所有的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)都來(lái)源實(shí)驗(yàn)樣本，如果想要得到一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就必須嚴(yán)格的把控實(shí)驗(yàn)樣本的采集和預(yù)處理，保存。 圖片 二、常規(guī)樣本的采集與保存有哪些訣竅？ 常規(guī)組學(xué)樣本的采集與保存避坑攻略，總結(jié)歸納為以下“七要素”，輕輕松松就能完成樣本的收集： 七要素： 一致：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組取樣一致性，如組織樣本組織塊的大小、取樣部位，血液樣本性別年齡的匹配，尿液樣本取樣時(shí)間等； 除雜：去除與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的雜質(zhì)，如動(dòng)物組織去血、植物組織去除泥土等污染物、菌體及細(xì)胞去除培養(yǎng)基等，推薦使用PBS緩沖液或者生理鹽水，吸水紙吸干殘留液體； 低溫：樣本預(yù)處理盡量低溫，可以在冰上進(jìn)行雜質(zhì)去除和分裝的操作，低溫保存，通常保存在-80℃冰箱； 分裝：根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融； 迅速：樣本收集，制備，存儲(chǔ)和運(yùn)輸應(yīng)盡可能的迅速，壓縮樣本采集到正式實(shí)驗(yàn)的時(shí)間； 標(biāo)記：用優(yōu)質(zhì)的記號(hào)筆清晰的標(biāo)記好樣品名稱，以免混淆樣本； 包裝：建議使用優(yōu)質(zhì)的離心管、凍存管收集樣本，以防在運(yùn)輸和操作過(guò)程中樣本管破裂以及聚合物對(duì)樣本造成污染，植物樣本可以用錫箔紙包裝，錫箔紙外面套一個(gè)自封袋以免運(yùn)輸過(guò)程中樣本灑落。 三、實(shí)驗(yàn)室常做的實(shí)驗(yàn)樣本應(yīng)該怎么處理？ 今天我們來(lái)整理一下，一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)樣本保存方法及注意事項(xiàng)，包括：分子實(shí)驗(yàn)、蛋白實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)等。 蛋白實(shí)驗(yàn)（WB/ELISA） 1.組織樣本：取新鮮組織，用無(wú)塵紙快速吸去血液，將組織剪成小塊，放入裝有液氮的錫箔紙中速凍后，放入液氮預(yù)冷的離心管中，液氮速凍5min后，-80度保存。 2.細(xì)胞樣本：收集細(xì)胞懸浮液于1.5ml的離心管中，離心去上清，PBS洗滌三次，液氮速凍5min后，-80 ℃保存。 3.血清樣本：收集全血，室溫放置2h，4℃ 3000rpm/min 離心10min，吸取上部的血清即可，-80度保存。 4.運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸 全血：新鮮抗凝血，避免劇烈震蕩，避免凝血；立即提取。 分子實(shí)驗(yàn)（RNA/DNA） （一）RNA提�。≦PCR/測(cè)序等） 1.組織樣本 組織取材在組織離體 30min 內(nèi)完成，取樣的動(dòng)作要盡量快速利索，將組織切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（盡可能剪碎），抽取 1ml TRIzol 溶液于 2ml凍存管內(nèi)，將樣本完全浸沒于TRIzol溶液(如0.4g樣本需要約2.0 mL TRIzol的溶液)。液氮速凍后，-80 度保存。 注意：為完全有效的保護(hù)組織樣本，該組織樣本應(yīng)完全浸沒入 TRIzol 溶液中并且組織樣本的任何一邊的最大厚度不應(yīng)超過(guò) 0.5 cm。 因?yàn)镽NA容易降解如不能立即進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)操作可使用儲(chǔ)存在 RNAlocker中，細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月，或永久保存在-20°C。 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞收集后用PBS緩沖液快速洗一次，每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml TRIzol，用槍頭反復(fù)抽打，直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；液氮速凍，-80 ℃保存。 3.血液樣本 1) 加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鮮血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1），用移液器吹打幾次以幫助裂解樣品中的細(xì)胞； 2) 樣品劇烈震蕩混勻1~2 min，直到絮狀物全部溶解； 3) 室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解； 4) 寫好編號(hào)，封口膜封存，-80 ℃凍存。 注意：冰凍血液溶解過(guò)程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此建議在冰凍前加入TRIzol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。 4.運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸； （二）DNA提取 1.組織樣本 取材后，PBS清洗2-3次，液氮速凍， -80 ℃保存； 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞收集沉淀后，液氮速凍， -80 ℃保存； 3.運(yùn)輸條件：冰袋運(yùn)輸； 病理實(shí)驗(yàn) （一）石蠟切片 1.組織樣本 取材后，PBS 清洗 2-3 次，使用 4%多聚甲醛固定，組織樣本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量應(yīng)足夠，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于 10:1。室溫保存。 注意：取材樣本要新鮮，否則細(xì)胞內(nèi)溶酶體會(huì)破裂，造成細(xì)胞自融。 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定30min，換PBS浸沒4度保存。 3.運(yùn)輸條件：常溫運(yùn)輸; 4.其他組織保存、固定等 圖片 (二)冰凍切片 1.動(dòng)物組織樣本 ① 1-3min內(nèi)取樣，取樣組織2mmX2mm大小，盡量薄。如來(lái)不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時(shí)左右待組織變硬以后再修整組織進(jìn)行后固定。超出此范圍后組織會(huì)無(wú)法完全固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無(wú)法完成，務(wù)必請(qǐng)重視此過(guò)程。 ② 取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。 ③ 取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。 ④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。4℃時(shí)樣本可保存1個(gè)月左右。 2.細(xì)胞樣本 貼壁細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞連接，將培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基不經(jīng)漂洗迅速加電鏡固定液用細(xì)胞刮沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞收集到離心管內(nèi)（避免刮破細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞形態(tài)形狀無(wú)特殊要求，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。 四、不能立即實(shí)驗(yàn)的樣品應(yīng)該怎么長(zhǎng)期保存？ 相信很多對(duì)比組比較多的研究課題一次性會(huì)取很多樣本，沒有辦法取材后立即進(jìn)行試驗(yàn)，需要對(duì)大量的樣品進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的保存，那么如何選擇合適的保存條件呢？首先我們應(yīng)該了解不同的儲(chǔ)存溫度對(duì)樣品會(huì)有哪些方面的影響？ 一、儲(chǔ)存溫度對(duì)樣本的影響 生物樣本的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，通常使用盡可能低的溫度來(lái)降低樣本內(nèi)的生化反應(yīng)，以提高樣本內(nèi)各種成分的穩(wěn)定性。生物大分子、細(xì)胞、組織和器官的常用儲(chǔ)存溫度為 -80℃（超低溫冰箱）、-140℃（液氮?dú)庀嗷蛏罾浔洌┘?-196℃（液氮液相），溫度越低樣本的穩(wěn)定保存時(shí)間越長(zhǎng)。 圖片 不同溫度對(duì)生物樣本的影響和保護(hù)作用 1) -60~ 0℃ 儲(chǔ)存 此溫度是水的結(jié)晶溫度，容易對(duì)細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成損害，一般不使用這一溫度來(lái)保存組織和細(xì)胞。且在組織樣本內(nèi)生物大分子受到細(xì)胞組織內(nèi)多種因素的影響，穩(wěn)定性有可能明顯降低，所以通常樣本庫(kù)不使用 -60~0℃ 作為儲(chǔ)存溫度。 圖片 2)-80℃ 儲(chǔ)存 -80℃ 是較常用的樣本保存溫度，也是常用超低溫冰箱所能達(dá)到的溫度�；诓僮骱�(jiǎn)便性、儲(chǔ)存量和成本等因素來(lái)考量，這一溫度也是目前保存樣本中生物大分子活性的常用溫度。 圖片 但對(duì)不同的生物大分子活性來(lái)說(shuō)，這一溫度下到底能保持多久的問(wèn)題仍然處于研究探索中。 組織中 DNA 的穩(wěn)定性較好，可以在 -80℃ 下保持?jǐn)?shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。但 RNA 則容易被廣泛分布于細(xì)胞和各種組織里的 RNA 酶降解。RNA 在穩(wěn)定劑中的儲(chǔ)存時(shí)間一般不超過(guò) 5 年。所以為長(zhǎng)期保存 RNA 活性，建議使用更低的溫度，或者利用小部分樣本提取 RNA 與剩余樣本同步儲(chǔ)存。其他樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子在 -80℃ 下也能保存，但時(shí)間長(zhǎng)短不一，穩(wěn)定性逐漸衰減。 3）-196℃ 儲(chǔ)存 -196℃ 是液氮揮發(fā)的溫度，所以只有液氮液相保存技術(shù)能達(dá)到此溫度。樣本內(nèi)的生理、生化活動(dòng)在此溫度下基本停止，穩(wěn)定性狀的樣本可以得到長(zhǎng)期保存。液氮保存是長(zhǎng)期保存樣本內(nèi)細(xì)胞活性、組織器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及活性的最有效方法，已廣為接受與認(rèn)可。 圖片 與其他不同溫度冷凍模式相比，液氮容器液相儲(chǔ)存樣本需要做好防護(hù)樣本間的交叉污染。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所推薦螺旋蓋并帶有橡膠密封圈的凍存管封裝樣本。但在降溫過(guò)程中樣本從超低溫冰箱（-80℃）轉(zhuǎn)移到液氮中時(shí)驟然降溫，引起凍存管管帽和管身收縮不一致，容易導(dǎo)致液氮滲入凍存管，從而增加樣本間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。解決的辦法之一是可以使用專門的凍存管管套對(duì)每個(gè)凍存管進(jìn)行熱縮密封，或是使用密封膜在凍存管管帽與管身接口處纏2~3圈再儲(chǔ)存。 液氮并不能做到真正無(wú)菌，它不能消毒，只能降低細(xì)菌、病毒的活性，這種潛在的生物危害會(huì)使浸泡在液氮中的樣本被污染。因此研究者又發(fā)明了一種新的液氮方法——?dú)庀嘁旱蓿瑢颖局糜谝旱魵庵�。雖然用氣相液氮罐存儲(chǔ)樣本也不是完全沒有風(fēng)險(xiǎn)，致病菌、真菌還是有可能生長(zhǎng)，但是因?yàn)闆]有液體介質(zhì)的存在，從而避免了交叉污染。 五、常見樣本儲(chǔ)存溫度怎么選擇？ 選擇儲(chǔ)存溫度應(yīng)考慮樣本的類型、預(yù)期儲(chǔ)存的時(shí)間、樣本中生物分子的特性、不同細(xì)胞的特性。 細(xì)菌和細(xì)胞的活性臨界溫度通常認(rèn)為是 -140℃，在這個(gè)溫度下，所有的代謝活動(dòng)都停止，對(duì)于能承受在此溫度下保存的樣本，建議選擇低于這個(gè)溫度進(jìn)行儲(chǔ)存，利于長(zhǎng)期穩(wěn)定的儲(chǔ)存。一些樣本不能承受這么低的溫度，它們的儲(chǔ)存溫度一般選擇 -80℃，在此溫度下，代謝活動(dòng)并沒有完全停止。另外，一些經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，則可在低溫和室溫條件下儲(chǔ)存。 1）固體組織樣本的儲(chǔ)存溫度： 長(zhǎng)期儲(chǔ)存的新鮮冰凍組織和 OCT 包埋冰凍組織應(yīng)儲(chǔ)存于液氮中，冰凍組織切片或者用于 DNA 和 RNA 提取的冰凍組織應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃。經(jīng)過(guò)福爾馬林固定的石蠟包埋組織及組織切片應(yīng)儲(chǔ)存在室溫，在低于 27℃ 的環(huán)境下，并控制蟲患和濕度。 2）液體樣本的儲(chǔ)存溫度： 對(duì)于液體樣本，包括血液和尿液，樣本里的各種成分應(yīng)在儲(chǔ)存前分離，使得每一種成分能夠在最佳條件下儲(chǔ)存。全血、血清、血凝塊、非淋巴細(xì)胞和血漿樣本應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃。血沉棕黃層和白細(xì)胞應(yīng)儲(chǔ)存在液氮中。尿液應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃ 或者液氮中。 3）細(xì)胞的儲(chǔ)存溫度： 長(zhǎng)期保存的細(xì)胞系應(yīng)儲(chǔ)存在液氮中。氣相液氮比液相液氮儲(chǔ)存樣本更好。雖然液相液氮的溫度更低一些（-196℃），但氣相液氮的溫度（-150℃）仍在臨界溫度之下。對(duì)于需要但沒有條件使用液氮保存的細(xì)胞樣本，應(yīng)至少儲(chǔ)存 -80℃ 環(huán)境中。 六、樣本的凍存和取用應(yīng)該注意什么？ 樣本儲(chǔ)存在穩(wěn)定的條件下，應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本反復(fù)凍融會(huì)加快生物大分子物質(zhì)的降解，嚴(yán)重影響樣本的質(zhì)量。樣本在凍存前，最好分裝成小份樣本再儲(chǔ)存，可以避免不必要的反復(fù)凍融，一般夠一次研究用量即可。 當(dāng)需要凍融樣本時(shí)，應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)流程確保樣本的穩(wěn)定性和質(zhì)量。樣本在凍存過(guò)程中應(yīng)采用合適的冷卻速度，控制冰晶大小，以及冰晶形成速度，這些將影響到樣本的質(zhì)量。 樣本使用時(shí)，需要采取必要的融化和復(fù)蘇。儲(chǔ)存的溫度越低，復(fù)蘇和融化所需的時(shí)間越長(zhǎng)。當(dāng)從冷凍狀態(tài)中解凍時(shí)，最好的方式是 37℃ 水浴，過(guò)程不宜太長(zhǎng)，避免損害樣本的生物活性。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
伙伴們，祝我生日快樂吧
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
274求調(diào)劑0856材料化工
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
337一志愿華南理工0805材料求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
（081700）化學(xué)工程與技術(shù)-298分求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
NSFC申報(bào)書里申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷中代表性論著還需要在申報(bào)書最后的附件里面再上傳一遍嗎
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
一志愿北京化工大學(xué)材料與化工296分求調(diào)劑
已經(jīng)有17人回復(fù)
-
0703化學(xué)一志愿211 總分320求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
0703求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
一志愿天津大學(xué)材料與化工275求調(diào)劑
已經(jīng)有22人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研實(shí)驗(yàn)_研實(shí) 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +4 | 步川酷紫123 2026-03-11 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿江南大學(xué)085701環(huán)境工程專碩總分287求調(diào)劑 +5 | 18266118446 2026-03-09 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 接受26屆調(diào)劑生 +22 | 豬豬豬毛 2026-03-06 | 23/1150 |
|
|
|
[碩博家園] 深圳大學(xué)碩士招生（2026秋，傳感器方向，僅錄取第一志愿） +4 | xujiaoszu 2026-03-11 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑，一志愿陜師大生物學(xué) +3 | ??????.?.??? 2026-03-09 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 279求調(diào)劑 +3 | 莫xiao 2026-03-10 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 327求調(diào)劑 +3 | Ffff03 2026-03-10 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +8 | 小木蟲085600 2026-03-09 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 2026考研求調(diào)劑-材料類-本科211一志愿985-初試301分 +10 | 蟲友233 2026-03-07 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑！ +3 | 朔朔話 2026-03-09 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑（085602一志愿985） +8 | 化工人999 2026-03-09 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿山東大學(xué)，總分327，英語(yǔ)二79，有論文，有競(jìng)賽，已過(guò)四六級(jí) +3 | 木木目目1 2026-03-09 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 313求調(diào)劑 +4 | Yyt楊1 2026-03-07 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +4 | xxxcm 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程專碩求調(diào)劑 +5 | 幼稚園大班打手 2026-03-08 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 誠(chéng)求調(diào)劑，323分 有專利/科研/實(shí)習(xí)經(jīng)歷 +6 | 橙子cyx 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料專碩323求調(diào)劑 +5 | 李白26 2026-03-07 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | 52hz~~ 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 哈爾濱理工大學(xué)2026年研究生調(diào)劑，材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院研究生調(diào)劑 +3 | xinliu866 2026-03-06 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 08工科求調(diào)劑 +3 | 隆LLL 2026-03-06 | 4/200 |
|