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科研實(shí)驗(yàn)_研實(shí)新蟲 (小有名氣)
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干貨分享 | 實(shí)驗(yàn)樣本保存的6條吐血經(jīng)驗(yàn)
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一、實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)來源于哪里？ 科研項(xiàng)目成功的關(guān)鍵是什么？合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)？嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作？等這些都是必不可少的因素之一。但是，還有一項(xiàng)目是容易被忽視-樣本，所有的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)都來源實(shí)驗(yàn)樣本，如果想要得到一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就必須嚴(yán)格的把控實(shí)驗(yàn)樣本的采集和預(yù)處理，保存。 圖片 二、常規(guī)樣本的采集與保存有哪些訣竅？ 常規(guī)組學(xué)樣本的采集與保存避坑攻略，總結(jié)歸納為以下“七要素”，輕輕松松就能完成樣本的收集： 七要素： 一致：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組取樣一致性，如組織樣本組織塊的大小、取樣部位，血液樣本性別年齡的匹配，尿液樣本取樣時(shí)間等； 除雜：去除與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的雜質(zhì)，如動(dòng)物組織去血、植物組織去除泥土等污染物、菌體及細(xì)胞去除培養(yǎng)基等，推薦使用PBS緩沖液或者生理鹽水，吸水紙吸干殘留液體； 低溫：樣本預(yù)處理盡量低溫，可以在冰上進(jìn)行雜質(zhì)去除和分裝的操作，低溫保存，通常保存在-80℃冰箱； 分裝：根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融； 迅速：樣本收集，制備，存儲(chǔ)和運(yùn)輸應(yīng)盡可能的迅速，壓縮樣本采集到正式實(shí)驗(yàn)的時(shí)間； 標(biāo)記：用優(yōu)質(zhì)的記號(hào)筆清晰的標(biāo)記好樣品名稱，以免混淆樣本； 包裝：建議使用優(yōu)質(zhì)的離心管、凍存管收集樣本，以防在運(yùn)輸和操作過程中樣本管破裂以及聚合物對(duì)樣本造成污染，植物樣本可以用錫箔紙包裝，錫箔紙外面套一個(gè)自封袋以免運(yùn)輸過程中樣本灑落。 三、實(shí)驗(yàn)室常做的實(shí)驗(yàn)樣本應(yīng)該怎么處理？ 今天我們來整理一下，一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)樣本保存方法及注意事項(xiàng)，包括：分子實(shí)驗(yàn)、蛋白實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)等。 蛋白實(shí)驗(yàn)（WB/ELISA） 1.組織樣本：取新鮮組織，用無塵紙快速吸去血液，將組織剪成小塊，放入裝有液氮的錫箔紙中速凍后，放入液氮預(yù)冷的離心管中，液氮速凍5min后，-80度保存。 2.細(xì)胞樣本：收集細(xì)胞懸浮液于1.5ml的離心管中，離心去上清，PBS洗滌三次，液氮速凍5min后，-80 ℃保存。 3.血清樣本：收集全血，室溫放置2h，4℃ 3000rpm/min 離心10min，吸取上部的血清即可，-80度保存。 4.運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸 全血：新鮮抗凝血，避免劇烈震蕩，避免凝血；立即提取。 分子實(shí)驗(yàn)（RNA/DNA） （一）RNA提�。≦PCR/測(cè)序等） 1.組織樣本 組織取材在組織離體 30min 內(nèi)完成，取樣的動(dòng)作要盡量快速利索，將組織切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（盡可能剪碎），抽取 1ml TRIzol 溶液于 2ml凍存管內(nèi)，將樣本完全浸沒于TRIzol溶液(如0.4g樣本需要約2.0 mL TRIzol的溶液)。液氮速凍后，-80 度保存。 注意：為完全有效的保護(hù)組織樣本，該組織樣本應(yīng)完全浸沒入 TRIzol 溶液中并且組織樣本的任何一邊的最大厚度不應(yīng)超過 0.5 cm。 因?yàn)镽NA容易降解如不能立即進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)操作可使用儲(chǔ)存在 RNAlocker中，細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長達(dá)1個(gè)月，或永久保存在-20°C。 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞收集后用PBS緩沖液快速洗一次，每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml TRIzol，用槍頭反復(fù)抽打，直至看不見成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；液氮速凍，-80 ℃保存。 3.血液樣本 1) 加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鮮血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1），用移液器吹打幾次以幫助裂解樣品中的細(xì)胞； 2) 樣品劇烈震蕩混勻1~2 min，直到絮狀物全部溶解； 3) 室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解； 4) 寫好編號(hào)，封口膜封存，-80 ℃凍存。 注意：冰凍血液溶解過程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此建議在冰凍前加入TRIzol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。 4.運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸； （二）DNA提取 1.組織樣本 取材后，PBS清洗2-3次，液氮速凍， -80 ℃保存； 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞收集沉淀后，液氮速凍， -80 ℃保存； 3.運(yùn)輸條件：冰袋運(yùn)輸； 病理實(shí)驗(yàn) （一）石蠟切片 1.組織樣本 取材后，PBS 清洗 2-3 次，使用 4%多聚甲醛固定，組織樣本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量應(yīng)足夠，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于 10:1。室溫保存。 注意：取材樣本要新鮮，否則細(xì)胞內(nèi)溶酶體會(huì)破裂，造成細(xì)胞自融。 2.細(xì)胞樣本 細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定30min，換PBS浸沒4度保存。 3.運(yùn)輸條件：常溫運(yùn)輸; 4.其他組織保存、固定等 圖片 (二)冰凍切片 1.動(dòng)物組織樣本 ① 1-3min內(nèi)取樣，取樣組織2mmX2mm大小，盡量薄。如來不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時(shí)左右待組織變硬以后再修整組織進(jìn)行后固定。超出此范圍后組織會(huì)無法完全固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法完成，務(wù)必請(qǐng)重視此過程。 ② 取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。 ③ 取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。 ④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。4℃時(shí)樣本可保存1個(gè)月左右。 2.細(xì)胞樣本 貼壁細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞連接，將培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基不經(jīng)漂洗迅速加電鏡固定液用細(xì)胞刮沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞收集到離心管內(nèi)（避免刮破細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞形態(tài)形狀無特殊要求，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。 四、不能立即實(shí)驗(yàn)的樣品應(yīng)該怎么長期保存？ 相信很多對(duì)比組比較多的研究課題一次性會(huì)取很多樣本，沒有辦法取材后立即進(jìn)行試驗(yàn)，需要對(duì)大量的樣品進(jìn)行較長時(shí)間的保存，那么如何選擇合適的保存條件呢？首先我們應(yīng)該了解不同的儲(chǔ)存溫度對(duì)樣品會(huì)有哪些方面的影響？ 一、儲(chǔ)存溫度對(duì)樣本的影響 生物樣本的長期儲(chǔ)存，通常使用盡可能低的溫度來降低樣本內(nèi)的生化反應(yīng)，以提高樣本內(nèi)各種成分的穩(wěn)定性。生物大分子、細(xì)胞、組織和器官的常用儲(chǔ)存溫度為 -80℃（超低溫冰箱）、-140℃（液氮?dú)庀嗷蛏罾浔洌┘?-196℃（液氮液相），溫度越低樣本的穩(wěn)定保存時(shí)間越長。 圖片 不同溫度對(duì)生物樣本的影響和保護(hù)作用 1) -60~ 0℃ 儲(chǔ)存 此溫度是水的結(jié)晶溫度，容易對(duì)細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)造成損害，一般不使用這一溫度來保存組織和細(xì)胞。且在組織樣本內(nèi)生物大分子受到細(xì)胞組織內(nèi)多種因素的影響，穩(wěn)定性有可能明顯降低，所以通常樣本庫不使用 -60~0℃ 作為儲(chǔ)存溫度。 圖片 2)-80℃ 儲(chǔ)存 -80℃ 是較常用的樣本保存溫度，也是常用超低溫冰箱所能達(dá)到的溫度�；诓僮骱啽阈浴�(chǔ)存量和成本等因素來考量，這一溫度也是目前保存樣本中生物大分子活性的常用溫度。 圖片 但對(duì)不同的生物大分子活性來說，這一溫度下到底能保持多久的問題仍然處于研究探索中。 組織中 DNA 的穩(wěn)定性較好，可以在 -80℃ 下保持?jǐn)?shù)年或更長時(shí)間。但 RNA 則容易被廣泛分布于細(xì)胞和各種組織里的 RNA 酶降解。RNA 在穩(wěn)定劑中的儲(chǔ)存時(shí)間一般不超過 5 年。所以為長期保存 RNA 活性，建議使用更低的溫度，或者利用小部分樣本提取 RNA 與剩余樣本同步儲(chǔ)存。其他樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子在 -80℃ 下也能保存，但時(shí)間長短不一，穩(wěn)定性逐漸衰減。 3）-196℃ 儲(chǔ)存 -196℃ 是液氮揮發(fā)的溫度，所以只有液氮液相保存技術(shù)能達(dá)到此溫度。樣本內(nèi)的生理、生化活動(dòng)在此溫度下基本停止，穩(wěn)定性狀的樣本可以得到長期保存。液氮保存是長期保存樣本內(nèi)細(xì)胞活性、組織器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及活性的最有效方法，已廣為接受與認(rèn)可。 圖片 與其他不同溫度冷凍模式相比，液氮容器液相儲(chǔ)存樣本需要做好防護(hù)樣本間的交叉污染。美國國家癌癥研究所推薦螺旋蓋并帶有橡膠密封圈的凍存管封裝樣本。但在降溫過程中樣本從超低溫冰箱（-80℃）轉(zhuǎn)移到液氮中時(shí)驟然降溫，引起凍存管管帽和管身收縮不一致，容易導(dǎo)致液氮滲入凍存管，從而增加樣本間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。解決的辦法之一是可以使用專門的凍存管管套對(duì)每個(gè)凍存管進(jìn)行熱縮密封，或是使用密封膜在凍存管管帽與管身接口處纏2~3圈再儲(chǔ)存。 液氮并不能做到真正無菌，它不能消毒，只能降低細(xì)菌、病毒的活性，這種潛在的生物危害會(huì)使浸泡在液氮中的樣本被污染。因此研究者又發(fā)明了一種新的液氮方法——?dú)庀嘁旱�，將樣本置于液氮蒸氣中。雖然用氣相液氮罐存儲(chǔ)樣本也不是完全沒有風(fēng)險(xiǎn)，致病菌、真菌還是有可能生長，但是因?yàn)闆]有液體介質(zhì)的存在，從而避免了交叉污染。 五、常見樣本儲(chǔ)存溫度怎么選擇？ 選擇儲(chǔ)存溫度應(yīng)考慮樣本的類型、預(yù)期儲(chǔ)存的時(shí)間、樣本中生物分子的特性、不同細(xì)胞的特性。 細(xì)菌和細(xì)胞的活性臨界溫度通常認(rèn)為是 -140℃，在這個(gè)溫度下，所有的代謝活動(dòng)都停止，對(duì)于能承受在此溫度下保存的樣本，建議選擇低于這個(gè)溫度進(jìn)行儲(chǔ)存，利于長期穩(wěn)定的儲(chǔ)存。一些樣本不能承受這么低的溫度，它們的儲(chǔ)存溫度一般選擇 -80℃，在此溫度下，代謝活動(dòng)并沒有完全停止。另外，一些經(jīng)過特殊處理的樣本，則可在低溫和室溫條件下儲(chǔ)存。 1）固體組織樣本的儲(chǔ)存溫度： 長期儲(chǔ)存的新鮮冰凍組織和 OCT 包埋冰凍組織應(yīng)儲(chǔ)存于液氮中，冰凍組織切片或者用于 DNA 和 RNA 提取的冰凍組織應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃。經(jīng)過福爾馬林固定的石蠟包埋組織及組織切片應(yīng)儲(chǔ)存在室溫，在低于 27℃ 的環(huán)境下，并控制蟲患和濕度。 2）液體樣本的儲(chǔ)存溫度： 對(duì)于液體樣本，包括血液和尿液，樣本里的各種成分應(yīng)在儲(chǔ)存前分離，使得每一種成分能夠在最佳條件下儲(chǔ)存。全血、血清、血凝塊、非淋巴細(xì)胞和血漿樣本應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃。血沉棕黃層和白細(xì)胞應(yīng)儲(chǔ)存在液氮中。尿液應(yīng)儲(chǔ)存在 -80℃ 或者液氮中。 3）細(xì)胞的儲(chǔ)存溫度： 長期保存的細(xì)胞系應(yīng)儲(chǔ)存在液氮中。氣相液氮比液相液氮儲(chǔ)存樣本更好。雖然液相液氮的溫度更低一些（-196℃），但氣相液氮的溫度（-150℃）仍在臨界溫度之下。對(duì)于需要但沒有條件使用液氮保存的細(xì)胞樣本，應(yīng)至少儲(chǔ)存 -80℃ 環(huán)境中。 六、樣本的凍存和取用應(yīng)該注意什么？ 樣本儲(chǔ)存在穩(wěn)定的條件下，應(yīng)避免反復(fù)凍融。樣本反復(fù)凍融會(huì)加快生物大分子物質(zhì)的降解，嚴(yán)重影響樣本的質(zhì)量。樣本在凍存前，最好分裝成小份樣本再儲(chǔ)存，可以避免不必要的反復(fù)凍融，一般夠一次研究用量即可。 當(dāng)需要凍融樣本時(shí)，應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)流程確保樣本的穩(wěn)定性和質(zhì)量。樣本在凍存過程中應(yīng)采用合適的冷卻速度，控制冰晶大小，以及冰晶形成速度，這些將影響到樣本的質(zhì)量。 樣本使用時(shí)，需要采取必要的融化和復(fù)蘇。儲(chǔ)存的溫度越低，復(fù)蘇和融化所需的時(shí)間越長。當(dāng)從冷凍狀態(tài)中解凍時(shí)，最好的方式是 37℃ 水浴，過程不宜太長，避免損害樣本的生物活性。 |
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