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手把手帶你了解真菌性角膜炎
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操作方法 1、真菌菌液的配制 菌液濃度從106～1010 CFU／ml不等，至今沒有一個統(tǒng)一的濃度標準。隨著菌液濃度的增加‚角膜的感染成功率提高，而一次接種達到106CFU就足以使所有角膜感染真菌。但是一次接種的菌液量很有限（0.005ml～0.1ml），這就需要配制的真菌菌液達到很高的濃度（至少達到107CFU／ml）。 2、角膜接種的方法 （1）角膜基質(zhì)注射法 使用帶28或30號針頭的0.5ml胰島素注射器，將0.05ml預(yù)制真菌菌液注入動物角膜中央基質(zhì)層內(nèi)，形成一定的容積，注射深度約角膜基質(zhì)的1／3深度，主要用于真菌性角膜炎藥物療效和診斷方法的研究。為了提高真菌的感染率和維持角膜的持續(xù)感染，部分研究在接種真菌之前一天，將實驗動物眼球結(jié)膜下注射一定量的皮質(zhì)類固醇激素（如12mg氟羥強的松龍），但是這種動物模型與真菌性角膜炎臨床病例自表面感染的自然病程很不相同，皮質(zhì)類固醇激素可以改變正常的真菌性角膜炎的病程，而且基質(zhì)內(nèi)注射在一定程度上破壞了角膜的正常結(jié)構(gòu)，所以不適合用以研究真菌感染角膜的發(fā)病機制、發(fā)生發(fā)展過程及感染組織病理學的研究。 （2）角膜接觸鏡法 接種真菌前，完整刮除兔角膜中央直徑7mm范圍的上皮，然后覆蓋上軟性角膜接觸鏡，在接觸鏡與角膜層間注入0.1ml白色念珠菌菌液（濃度1010CFU／ml），再行暫時性瞼裂縫合術(shù)，24小時后打開瞼裂并去除角膜接觸鏡，此方法近似人角膜感染的病程，即真菌孢子沉著于去除上皮的角膜表面，生長并產(chǎn)生菌絲侵入角膜基質(zhì)。 缺點：但是經(jīng)過皮質(zhì)類固醇激素處理的動物，其角膜感染重，真菌菌絲浸潤范圍深而廣，而且與使用皮質(zhì)類固醇激素的劑量成正比。雖然文獻報道此法建立的動物模型相對模擬臨床上人角膜真菌感染的情況，感染成功率較高，可不依賴皮質(zhì)類固醇激素，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于念珠菌性角膜炎的組織病理學研究，但是實驗中所應(yīng)用的真菌菌液濃度很高，達到2×109或1010CFU／ml，這一濃度幾乎是基質(zhì)注射法所采用的數(shù)十甚至上百倍，據(jù)真菌感染機體發(fā)病機制的研究，其發(fā)病除與致病菌種、真菌毒力、機體免疫狀態(tài)有關(guān)，還可能與真菌數(shù)量有關(guān)，過高濃度的真菌菌液是否引起真菌性角膜炎病變過重，其病程是否存在差別，目前尚無明確的研究結(jié)果，所以此方法并不完全近似臨床真菌感染角膜的實際情況；而且其僅研究了白色念珠菌，對于發(fā)展中國家中最常見的鐮刀菌屬，缺乏相關(guān)研究。 （3）角膜表面鏡片術(shù)法 刮除角膜中央部分上皮（約6mm）后，將預(yù)制的全厚異體角膜植片（甘油冷凍保存）縫在動物角膜表面，層間注入一定量的真菌菌液，接種后24小時移去角膜植片。 優(yōu)缺點：此方法不依賴皮質(zhì)類固醇激素，所應(yīng)用的真菌菌液濃度相對較低，角膜植片以縫線固定，其層間空間穩(wěn)固，保證了真菌成分與創(chuàng)傷角膜表面的充分接觸，創(chuàng)造了適合真菌生存繁殖的良好環(huán)境，其感染成功率高，近100％，可重復(fù)性較好；但是此方法操作過程相對復(fù)雜，對實驗者的手術(shù)技術(shù)水平有一定的要求。 感染成功后的鑒定 真菌培養(yǎng)檢查是最基本的手段，準確率較高而且較簡單，也是真菌鑒定的金標準。對感染組織進行真菌培養(yǎng)，常規(guī)鑒定使用的培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）斜面培養(yǎng)基，加0.05％氯霉素，經(jīng)過至少72小時后待培養(yǎng)基表面有真菌菌落生長后觀察并鑒定菌種，霉菌常用形態(tài)學鑒定，而酵母常以形態(tài)和生理結(jié)合方法鑒定。 感染角膜取活體組織進行組織病理學檢查也是真菌菌種鑒定的重要方法，但不夠準確特異，需進一步借助更為特異的方法來鑒定。免疫組織化學方法可通過檢測真菌特異性抗原來診斷組織中的真菌病原體，除特異性外，免疫組織化學技術(shù)比組織化學方法更為敏感，是僅次于培養(yǎng)法這一金標準的最特異的診斷手段。 感染后角膜病變的觀測和量化 目前常用裂隙燈顯微鏡觀察角膜感染灶并行大體及裂隙照相，記錄角膜病灶形態(tài)、感染范圍、深度及前房反應(yīng)情況進行臨床評分，評分標準可參照 O’DAY改進方法。 重點為根據(jù)角膜感染灶范圍分為0～4共5級；根據(jù)角膜病變深度分為0～4共5級；根據(jù)前房反應(yīng)程度分為0～4共5級；依據(jù)以上三個標準對每一眼進行臨床評分，綜合三個分數(shù)為該眼總分，將角膜感染量化。 總結(jié) 醫(yī)學科學的嚴謹性要求在真菌性角膜炎的基礎(chǔ)研究中，需要建立一種成功率高、病程的發(fā)生發(fā)展模擬人角膜感染的過程、統(tǒng)一采用的動物模型制作方法，保證動物實驗研究的成果客觀、可信、可重復(fù)，服務(wù)于臨床對真菌性角膜炎的防治，降低此種疾病的致盲率，從而推動眼科感染性角膜病科學研究的進步，這需要廣大醫(yī)學工作者不懈努力，不斷嘗試摸索實現(xiàn)這一目標。 |
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