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基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)外?/a>新蟲 (初入文壇)
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手把手帶你了解真菌性角膜炎
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操作方法 1、真菌菌液的配制 菌液濃度從106～1010 CFU／ml不等，至今沒有一個(gè)統(tǒng)一的濃度標(biāo)準(zhǔn)。隨著菌液濃度的增加‚角膜的感染成功率提高，而一次接種達(dá)到106CFU就足以使所有角膜感染真菌。但是一次接種的菌液量很有限（0.005ml～0.1ml），這就需要配制的真菌菌液達(dá)到很高的濃度（至少達(dá)到107CFU／ml）。 2、角膜接種的方法 （1）角膜基質(zhì)注射法 使用帶28或30號(hào)針頭的0.5ml胰島素注射器，將0.05ml預(yù)制真菌菌液注入動(dòng)物角膜中央基質(zhì)層內(nèi)，形成一定的容積，注射深度約角膜基質(zhì)的1／3深度，主要用于真菌性角膜炎藥物療效和診斷方法的研究。為了提高真菌的感染率和維持角膜的持續(xù)感染，部分研究在接種真菌之前一天，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼球結(jié)膜下注射一定量的皮質(zhì)類固醇激素（如12mg氟羥強(qiáng)的松龍），但是這種動(dòng)物模型與真菌性角膜炎臨床病例自表面感染的自然病程很不相同，皮質(zhì)類固醇激素可以改變正常的真菌性角膜炎的病程，而且基質(zhì)內(nèi)注射在一定程度上破壞了角膜的正常結(jié)構(gòu)，所以不適合用以研究真菌感染角膜的發(fā)病機(jī)制、發(fā)生發(fā)展過程及感染組織病理學(xué)的研究。 （2）角膜接觸鏡法 接種真菌前，完整刮除兔角膜中央直徑7mm范圍的上皮，然后覆蓋上軟性角膜接觸鏡，在接觸鏡與角膜層間注入0.1ml白色念珠菌菌液（濃度1010CFU／ml），再行暫時(shí)性瞼裂縫合術(shù)，24小時(shí)后打開瞼裂并去除角膜接觸鏡，此方法近似人角膜感染的病程，即真菌孢子沉著于去除上皮的角膜表面，生長(zhǎng)并產(chǎn)生菌絲侵入角膜基質(zhì)。 缺點(diǎn)：但是經(jīng)過皮質(zhì)類固醇激素處理的動(dòng)物，其角膜感染重，真菌菌絲浸潤(rùn)范圍深而廣，而且與使用皮質(zhì)類固醇激素的劑量成正比。雖然文獻(xiàn)報(bào)道此法建立的動(dòng)物模型相對(duì)模擬臨床上人角膜真菌感染的情況，感染成功率較高，可不依賴皮質(zhì)類固醇激素，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于念珠菌性角膜炎的組織病理學(xué)研究，但是實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的真菌菌液濃度很高，達(dá)到2×109或1010CFU／ml，這一濃度幾乎是基質(zhì)注射法所采用的數(shù)十甚至上百倍，據(jù)真菌感染機(jī)體發(fā)病機(jī)制的研究，其發(fā)病除與致病菌種、真菌毒力、機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)，還可能與真菌數(shù)量有關(guān)，過高濃度的真菌菌液是否引起真菌性角膜炎病變過重，其病程是否存在差別，目前尚無(wú)明確的研究結(jié)果，所以此方法并不完全近似臨床真菌感染角膜的實(shí)際情況；而且其僅研究了白色念珠菌，對(duì)于發(fā)展中國(guó)家中最常見的鐮刀菌屬，缺乏相關(guān)研究。 （3）角膜表面鏡片術(shù)法 刮除角膜中央部分上皮（約6mm）后，將預(yù)制的全厚異體角膜植片（甘油冷凍保存）縫在動(dòng)物角膜表面，層間注入一定量的真菌菌液，接種后24小時(shí)移去角膜植片。 優(yōu)缺點(diǎn)：此方法不依賴皮質(zhì)類固醇激素，所應(yīng)用的真菌菌液濃度相對(duì)較低，角膜植片以縫線固定，其層間空間穩(wěn)固，保證了真菌成分與創(chuàng)傷角膜表面的充分接觸，創(chuàng)造了適合真菌生存繁殖的良好環(huán)境，其感染成功率高，近100％，可重復(fù)性較好；但是此方法操作過程相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的手術(shù)技術(shù)水平有一定的要求。 感染成功后的鑒定 真菌培養(yǎng)檢查是最基本的手段，準(zhǔn)確率較高而且較簡(jiǎn)單，也是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)感染組織進(jìn)行真菌培養(yǎng)，常規(guī)鑒定使用的培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）斜面培養(yǎng)基，加0.05％氯霉素，經(jīng)過至少72小時(shí)后待培養(yǎng)基表面有真菌菌落生長(zhǎng)后觀察并鑒定菌種，霉菌常用形態(tài)學(xué)鑒定，而酵母常以形態(tài)和生理結(jié)合方法鑒定。 感染角膜取活體組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查也是真菌菌種鑒定的重要方法，但不夠準(zhǔn)確特異，需進(jìn)一步借助更為特異的方法來鑒定。免疫組織化學(xué)方法可通過檢測(cè)真菌特異性抗原來診斷組織中的真菌病原體，除特異性外，免疫組織化學(xué)技術(shù)比組織化學(xué)方法更為敏感，是僅次于培養(yǎng)法這一金標(biāo)準(zhǔn)的最特異的診斷手段。 感染后角膜病變的觀測(cè)和量化 目前常用裂隙燈顯微鏡觀察角膜感染灶并行大體及裂隙照相，記錄角膜病灶形態(tài)、感染范圍、深度及前房反應(yīng)情況進(jìn)行臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可參照 O’DAY改進(jìn)方法。 重點(diǎn)為根據(jù)角膜感染灶范圍分為0～4共5級(jí)；根據(jù)角膜病變深度分為0～4共5級(jí)；根據(jù)前房反應(yīng)程度分為0～4共5級(jí)；依據(jù)以上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一眼進(jìn)行臨床評(píng)分，綜合三個(gè)分?jǐn)?shù)為該眼總分，將角膜感染量化。 總結(jié) 醫(yī)學(xué)科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)性要求在真菌性角膜炎的基礎(chǔ)研究中，需要建立一種成功率高、病程的發(fā)生發(fā)展模擬人角膜感染的過程、統(tǒng)一采用的動(dòng)物模型制作方法，保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的成果客觀、可信、可重復(fù)，服務(wù)于臨床對(duì)真菌性角膜炎的防治，降低此種疾病的致盲率，從而推動(dòng)眼科感染性角膜病科學(xué)研究的進(jìn)步，這需要廣大醫(yī)學(xué)工作者不懈努力，不斷嘗試摸索實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。 |
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