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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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分子克隆實(shí)驗(yàn)——無(wú)縫克隆 已有1人參與
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[交流] 無(wú)縫克隆常見(jiàn)問(wèn)題解答 無(wú)縫克隆常見(jiàn)問(wèn)題解答 分子克隆實(shí)驗(yàn)——無(wú)縫克隆 今天和大家講講無(wú)縫克隆常見(jiàn)的問(wèn)題以及解決方法。 1.平板上很少或者沒(méi)有克隆菌落 建議使用試劑盒附帶的陽(yáng)性對(duì)照，可排除試劑盒本身的影響。進(jìn)一步判定，主要有以下可能的情況和建議： 01 載體制備 線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。 02 插入片段制備 1、引物設(shè)計(jì)不正確：同源臂15~25nt（不計(jì)算酶切位點(diǎn)）,CG含量40~60%。 2、線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應(yīng)。若線性化載體與插入片段已經(jīng)過(guò)純化，且經(jīng)電泳檢測(cè)條帶單一或無(wú) Smear 殘留時(shí)，可使用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行濃度測(cè)定，當(dāng) A260/A280 在 1.8~2.0 之間時(shí)，濃度值可信，未純化的DNA使用體積不能超過(guò)反應(yīng)體積的1/5。 03 無(wú)縫克隆 線性化載體和插入片段的投入量不足或過(guò)量，比例不佳：按照明書(shū)推薦的最適用量和比例配制反應(yīng)體系。 04 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)效率低：感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/ug，重組產(chǎn)物的體積不能超過(guò)感受態(tài)的1/10。 2.多數(shù)克隆不含插入片段（假陽(yáng)性） 主要有以下可能的情況和建議： 01 載體制備： ✿載體線性化不徹底：設(shè)置陰性對(duì)照檢測(cè)載體是否線性化完全。 ✿相同抗性的質(zhì)粒污染：以質(zhì)粒為模板進(jìn)行插入片段 PCR 擴(kuò)增時(shí)，使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。 02 插入片段制備： 插入片段的制備產(chǎn)物不特異：優(yōu)化PCR體系（Tm,模板投入量，循環(huán)數(shù)等），提高特異性；膠回收PCR產(chǎn)物。 03 克隆篩選： 平板抗性不足：確保使用正確的抗生素，并使用新鮮制備的抗生素平板。 3.菌落PCR無(wú)條帶 主要有以下可能的情況和建議： 01 載體制備： 重組失敗：若只有空質(zhì)粒條帶，表明重組失敗，載體線性化不徹底，優(yōu)化酶切體系或PCR體系。 02 插入片段制備： 引物不正確，使用通用引物或者至少一條通用引物進(jìn)行菌檢。 03 克隆篩選： PCR體系或者程序不合適：沒(méi)有目的條帶也沒(méi)有空質(zhì)粒條帶，優(yōu)化PCR體系和程序（Tm，模板投入量，循環(huán)數(shù)等）；進(jìn)行提質(zhì)粒做模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證或者酶切驗(yàn)證。 |
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088213
新蟲(chóng) (初入文壇)
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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請(qǐng)問(wèn)菌P驗(yàn)證條帶正確，但測(cè)序測(cè)不通是為什么呢 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
2樓2024-05-05 23:57:44
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