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科研戰(zhàn)神·王

鐵蟲 (小有名氣)

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[交流] 分子克隆實驗——無縫克隆已有1人參與

[交流] 無縫克隆常見問題解答
無縫克隆常見問題解答

分子克隆實驗——無縫克隆

今天和大家講講無縫克隆常見的問題以及解決方法。

1.平板上很少或者沒有克隆菌落

建議使用試劑盒附帶的陽性對照，可排除試劑盒本身的影響。進一步判定，主要有以下可能的情況和建議：

01
載體制備
線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應。

02
插入片段制備
1、引物設計不正確：同源臂15~25nt（不計算酶切位點）,CG含量40~60%。

2、線性化載體和插入片段的純度不夠，抑制反應。若線性化載體與插入片段已經(jīng)過純化，且經(jīng)電泳檢測條帶單一或無 Smear 殘留時，可使用超微量核酸蛋白檢測儀進行濃度測定，當 A260/A280 在 1.8~2.0 之間時，濃度值可信，未純化的DNA使用體積不能超過反應體積的1/5。

03
無縫克隆
線性化載體和插入片段的投入量不足或過量，比例不佳：按照明書推薦的最適用量和比例配制反應體系。

04
轉化
感受態(tài)效率低：感受態(tài)轉化效率大于108 cfu/ug，重組產(chǎn)物的體積不能超過感受態(tài)的1/10。

2.多數(shù)克隆不含插入片段（假陽性）

主要有以下可能的情況和建議：

01
載體制備：
✿載體線性化不徹底：設置陰性對照檢測載體是否線性化完全。

✿相同抗性的質粒污染：以質粒為模板進行插入片段 PCR 擴增時，使用預線性化質粒作為擴增模板，使用 DpnI 等甲基化敏感型內切酶對擴增產(chǎn)物進行處理，或對產(chǎn)物進行膠回收純化。

02
插入片段制備：
插入片段的制備產(chǎn)物不特異：優(yōu)化PCR體系（Tm,模板投入量，循環(huán)數(shù)等），提高特異性；膠回收PCR產(chǎn)物。

03
克隆篩選：
平板抗性不足：確保使用正確的抗生素，并使用新鮮制備的抗生素平板。

3.菌落PCR無條帶
主要有以下可能的情況和建議：

01
載體制備：
重組失�。喝糁挥锌召|粒條帶，表明重組失敗，載體線性化不徹底，優(yōu)化酶切體系或PCR體系。

02
插入片段制備：
引物不正確，使用通用引物或者至少一條通用引物進行菌檢。

03
克隆篩選：
PCR體系或者程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質粒條帶，優(yōu)化PCR體系和程序（Tm，模板投入量，循環(huán)數(shù)等）；進行提質粒做模板，進行PCR驗證或者酶切驗證。

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1樓 2024-04-19 10:41:31

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088213

新蟲 (初入文壇)

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★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖

請問菌P驗證條帶正確，但測序測不通是為什么呢

發(fā)自小木蟲IOS客戶端

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2樓2024-05-05 23:57:44

已閱回復此樓關注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

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