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DNA提取試劑盒的操作方法
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全套操作約需1小時，分勻漿、細(xì)胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細(xì)說明如下。勻漿和細(xì)胞裂解: 使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟，具體說明如下：【從動物組織中提取基因組DNA】使用研缽進(jìn)行勻漿時：① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。A．富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。C．富含角質(zhì)蛋白的組織或堅硬的組織（如骨骼）等。② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。注）使用上述①-注）的實驗材料時，請在加入Solution A及RNase A1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補(bǔ)充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。使用研磨棒進(jìn)行勻漿時:① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘�！緩闹参锊牧匣蛑参锱囵B(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】① 按下表稱取適量的新鮮植物材料（如選用的是冷凍干燥植物材料，則用量減半），剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍完全后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。植物材料種類植物材料使用量*植物花、葉片10～100 mg植物莖60～240 mg植物根80～240 mg植物種子80～240 mg * 如選取植物的根、種子等樣品時，因其基因組DNA含量很低，需使用超過表格中所示的參數(shù)用量，此時請分兩管進(jìn)行步驟1～6的實驗操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一Spin Column中過濾，使各管的基因組DNA結(jié)合到同一個Spin Column上。如從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取基因組DNA，請離心收集2×103～1×107的培養(yǎng)植物細(xì)胞，加入150 μl水充分懸浮細(xì)胞后移入研缽中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。注）樣品研磨應(yīng)充分，否則將會嚴(yán)重影響基因組DNA的收率。② 將研缽移至65℃水浴，當(dāng)樣品粉末剛開始融化時，向研缽中加入700 μl的Solution A和1.2 μl的RNase A1，用力碾磨30秒。③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿移至Collection Tube中。如勻漿體積不足650 μl，請補(bǔ)充Solution A至650 μl。65℃保溫15分鐘。注）處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等時，可延長水浴時間至60分鐘。 【從全血中提取基因組DNA】① 取10～250 μl的全血（含抗凝劑）加入至Collection Tube中。② 加入500 μl的Solution A。③ 加入1 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘后，冰浴5分鐘。注） 人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250 μl；禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10 μl。 【從培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】三.使用懸浮培養(yǎng)的動物細(xì)胞時：① 使用Collection Tube收集1×105～1.5×107的細(xì)胞懸浮液，5,000 rpm離心5分鐘，棄上清（細(xì)胞培養(yǎng)液）。② 加入150 μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細(xì)胞。③ 加入500 μl的Solution A和0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。 四.使用貼壁細(xì)胞時：① 棄盡培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入650 μl的Solution A，室溫靜置1分鐘。注）96孔板等的每個孔中一次容納不了650 μl 溶液時，請分?jǐn)?shù)次處理細(xì)胞。② 用移液槍的槍頭吹落貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，取650 μl的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至Collection Tube中。③ 加入0.8 μl的RNase A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。2. 加入400 μl的Solution B，振蕩混合。3. 加入1 ml的4℃預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。4. 棄去上層有機(jī)相，再加入1 ml的4℃預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12,000 rpm離心2分鐘。5. 棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液（無色下層）轉(zhuǎn)移至置于Collection Tube上的Filter Cup中，12,000 rpm離心1分鐘。注）有機(jī)相（上層）帶有顏色，請務(wù)必除盡，否則會阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮，在過濾時將被去除。6. 棄Filter Cup，在濾液中加入400 μl的DB Buffer，混合均勻。7. 將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。將上述操作6混合溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12,000 rpm離心1分鐘，棄濾液。8. 將500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。9. 將700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm離心30秒鐘，棄濾液。注）請沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的鹽份。10. 重復(fù)操作步驟9。11. 將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50～200 μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。注）把滅菌蒸餾水或Elution Buffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。12. 12, 000 rpm離心1分鐘洗脫DNA。如果實驗室備有適合于Spin Column接口的負(fù)壓裝置，可從上述操作步驟6完成以后進(jìn)行以下操作。 公眾號：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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