 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 466 | 回復(fù): 0 | |||
科研戰(zhàn)神·王鐵蟲(chóng) (小有名氣)
|
[交流]
雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)
|
|
雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè) 近年來(lái)，非編碼RNA（Non-coding RNA）的研究成為熱點(diǎn)，特別是microRNA的研究。當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的miRNA，并研究其是否對(duì)相關(guān)疾病具有調(diào)控作用時(shí)，就需先對(duì)它和靶基因的調(diào)控關(guān)系做一驗(yàn)證，而目前最常用的靶向關(guān)系的驗(yàn)證方法就是：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。本文就相關(guān)檢測(cè)原理、螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎螢光素酶、報(bào)告基因、檢測(cè)步驟、細(xì)胞裂解及Luciferase檢測(cè)作簡(jiǎn)單介紹。 檢測(cè)原理 由于miRNA主要是通過(guò)作用于靶基因的3'UTR區(qū)域，這樣就可以將目的基因3'UTR區(qū)域構(gòu)建至含有報(bào)告基因螢光素酶的載體上，通過(guò)比較miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映出miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法還可以進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)。 螢火蟲(chóng)螢光素酶 螢火蟲(chóng)熒光素是從甲蟲(chóng)（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化熒光素(luciferin)氧化成氧化熒光素(oxyluciferin)，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。螢火蟲(chóng)螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。 海腎螢光素酶 海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素(coelenterazine)發(fā)生氧化，在coelenterazine氧化的過(guò)程中也會(huì)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為465nm。 生物螢光可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量。 報(bào)告基因 報(bào)告基因（report gene）是指一組編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，可通過(guò)報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)“報(bào)告”目的基因的表達(dá)調(diào)控。 檢測(cè)步驟 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染： （1）轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞計(jì)數(shù)，取2mL加入6孔板中，使得孔板的細(xì)胞密度不低于5*105個(gè)； （2）對(duì)于每孔細(xì)胞，用250uL的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2μg DNA（質(zhì)粒），室溫孵育5min； （3）對(duì)于每孔細(xì)胞，用250uL的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋5uL Lipo2000，室溫孵育5min； （4） 將2和3中的液體混合，室溫孵育20min； （5） 將預(yù)先分好的貼壁細(xì)胞換成無(wú)血清培養(yǎng)基，加入上述復(fù)合物，在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)6h，再換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)，72h檢測(cè)轉(zhuǎn)染水平。 細(xì)胞裂解及Luciferase檢測(cè) RLU值的計(jì)算：在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲(chóng)螢光素酶測(cè)定得到的RLU1值除以海腎螢光素酶測(cè)定得到的RLU2值。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。如果以螢火蟲(chóng)螢光素酶為內(nèi)參，也可以進(jìn)行類似計(jì)算。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有231人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研戰(zhàn)神·王 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 牛乳糖的卡卡 2026-03-10 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考博] 讀博申請(qǐng) +3 | 感dd 2026-03-10 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 哈工大材料324求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-10 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0817一志愿蘇州大學(xué)280復(fù)試調(diào)劑 +9 | kk扛 2026-03-07 | 9/450 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)]
PDF在線壓縮軟件
 10+3
|
haxia 2026-03-08 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程295求調(diào)劑，一志愿A區(qū)211 +8 | 等春來(lái)， 2026-03-06 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +5 | thext 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +4 | xxxcm 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | squirtle11 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 26申博自薦 +9 | 烷基八氮- 2026-03-06 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +3 | 胡達(dá)靈 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0701-322 求調(diào)劑 +3 | jiliuxian 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 拾柒12。 2026-03-08 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 322分 085600求調(diào)劑，有互聯(lián)網(wǎng)+國(guó)金及主持省級(jí)大創(chuàng)經(jīng)歷 +4 | 熊境喆 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +4 | 劉合華 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 334求調(diào)劑 +3 | Trying] 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料085600 303求調(diào)劑 +7 | 1bygone 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +4 | xuyuan111 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601 材料305分求助 +4 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|