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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 雙熒光素酶報告基因的檢測
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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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雙熒光素酶報告基因的檢測
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雙熒光素酶報告基因的檢測 近年來，非編碼RNA（Non-coding RNA）的研究成為熱點，特別是microRNA的研究。當發(fā)現一個新的miRNA，并研究其是否對相關疾病具有調控作用時，就需先對它和靶基因的調控關系做一驗證，而目前最常用的靶向關系的驗證方法就是：雙熒光素酶報告基因檢測。本文就相關檢測原理、螢火蟲熒光素酶、海腎螢光素酶、報告基因、檢測步驟、細胞裂解及Luciferase檢測作簡單介紹。 檢測原理 由于miRNA主要是通過作用于靶基因的3'UTR區(qū)域，這樣就可以將目的基因3'UTR區(qū)域構建至含有報告基因螢光素酶的載體上，通過比較miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后報告基因表達的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映出miRNA對目的基因的抑制作用。結合定點突變等方法還可以進一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點。 螢火蟲螢光素酶 螢火蟲熒光素是從甲蟲（Photinus pyralis）中分離得到，分子量為61kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化熒光素(luciferin)氧化成氧化熒光素(oxyluciferin)，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強發(fā)光波長為560nm。 海腎螢光素酶 海腎（Renilla）熒光素酶則是從海腎（Renilla reniformis）中分離，分子量為36kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素(coelenterazine)發(fā)生氧化，在coelenterazine氧化的過程中也會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強發(fā)光波長為465nm。 生物螢光可以通過熒光酶標儀進行測定，從而對實驗結果進行定量。 報告基因 報告基因（report gene）是指一組編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，可通過報告基因產物的表達來“報告”目的基因的表達調控。 檢測步驟 常規(guī)培養(yǎng)細胞后進行細胞轉染： （1）轉染前一天將細胞計數，取2mL加入6孔板中，使得孔板的細胞密度不低于5*105個； （2）對于每孔細胞，用250uL的無血清培養(yǎng)基稀釋2μg DNA（質粒），室溫孵育5min； （3）對于每孔細胞，用250uL的無血清培養(yǎng)基稀釋5uL Lipo2000，室溫孵育5min； （4） 將2和3中的液體混合，室溫孵育20min； （5） 將預先分好的貼壁細胞換成無血清培養(yǎng)基，加入上述復合物，在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)6h，再換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)，72h檢測轉染水平。 細胞裂解及Luciferase檢測 RLU值的計算：在以海腎螢光素酶為內參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的RLU1值除以海腎螢光素酶測定得到的RLU2值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內參，也可以進行類似計算。 |
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