 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 609 | 回復(fù): 0 | |||
科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
|
[交流]
細(xì)胞免疫熒光
|
|
細(xì)胞免疫熒光，看完必會(huì)！ 一、免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。 二、細(xì)胞免疫熒光 主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)抗原抗體檢測(cè)，適用于細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)。 1、直接法 將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。 2、間接法（較為常用） 如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。 操作步驟（以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原為例） （1）倒出培養(yǎng)液。 （2）潤(rùn)洗，將1ml SD完全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤(rùn)洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。 （3）吹打，加入2ml SD完全培養(yǎng)基，打在培養(yǎng)板底部，然后反復(fù)抽打，直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该鳌＃ù荡蛑蠓胖�，后使用之前都要反�?fù)吹打） （4）將細(xì)胞爬片放入24孔板，每孔一個(gè)（注意每個(gè)孔只放一個(gè)，不要多放，注意檢查）。 （5）往（3）中吹打后的細(xì)胞液中繼續(xù)加4ml的SD完全培養(yǎng)基（即總計(jì)6ml）。將細(xì)胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細(xì)胞沉降而造成的不均勻），每個(gè)板500ul。注意事項(xiàng)：每一步打開細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，防止細(xì)胞培養(yǎng)板蓋時(shí)勿使細(xì)胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。 （6）在將細(xì)胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前，請(qǐng)噴酒精。 （7）細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)之內(nèi)使用，最好20小時(shí)。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤(rùn)洗2次，沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側(cè)壁吸出。 （8）Pfu number/細(xì)胞數(shù)=pfuV/細(xì)胞數(shù)=感染復(fù)數(shù) 感染復(fù)數(shù)為2，加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復(fù)數(shù)為15，加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測(cè)定為1*10-7pfu/ml （9）先加SD培養(yǎng)基再加病毒。（24h或48h之后進(jìn)行（10）） （10）固定細(xì)胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。 （11）PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。 （12）細(xì)胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。 （13）封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween) BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。 （14）一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說明書）稀釋，300ul/孔，4攝氏度過夜。 （15）PBST（Tween）洗3次，10min/次 。 （16）二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋，300ul/孔，室溫避光1h。 （17）PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。 （18）PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。 （19）載玻片上滴加封片液，細(xì)胞爬片的細(xì)胞層與封片液接觸。 （20）熒光共聚焦顯微鏡觀察。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
一志愿河海大學(xué)085900土木水利專碩279求調(diào)劑不挑專業(yè)
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
085600 材料與化工 295 求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
290求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
伙伴們，祝我生日快樂吧
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
281求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
工科278分求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
考研一志愿長(zhǎng)安大學(xué)材料與化工309分請(qǐng)求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
304求調(diào)劑（085602一志愿985）
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
0856材料與化工309分求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
282分材料專業(yè)求調(diào)劑院校
已經(jīng)有24人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研戰(zhàn)神·王 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 282分材料專業(yè)求調(diào)劑院校 +17 | 楓橋ZL 2026-03-09 | 24/1200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑，材料、化工皆可 +5 | 蘇打水7777 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
[考研] 0703求調(diào)劑 +6 | jtyq001 2026-03-10 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0857 資源與環(huán)境 285分 +6 | 未名考生 2026-03-09 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 接受26屆調(diào)劑生 +22 | 豬豬豬毛 2026-03-06 | 23/1150 |
|
|
|
[考研] 081200計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)數(shù)一英一306求調(diào)劑 +3 | intankt 2026-03-08 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料371求調(diào)劑 +7 | 鱷魚? 2026-03-11 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 大連大學(xué)化學(xué)專業(yè)研究生調(diào)劑 +3 | 琪久. 2026-03-10 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥319分求調(diào)劑 +4 | Tolkien 2026-03-07 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 一志愿蘇州大學(xué)，0856化工323分 | 本科應(yīng)化 | 有專利/競(jìng)賽/科研助手經(jīng)歷 | +7 | 橙子cyx 2026-03-06 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 085701環(huán)境工程295求調(diào)劑，一志愿A區(qū)211 +8 | 等春來， 2026-03-06 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 294 英二數(shù)二物化 求調(diào)劑 +6 | 米飯團(tuán)不好吃 2026-03-09 | 6/300 |
|
|
|
[碩博家園] 2026級(jí)碩士研究生招生/調(diào)劑 +3 | 知足常樂的樂 2026-03-06 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +4 | 很老實(shí)人 2026-03-09 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研求調(diào)劑，工科，總分304 +4 | 矮子不想長(zhǎng)高了 2026-03-08 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿華中科大0702，數(shù)一英一，293 +4 | 小羅露一二 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0307化學(xué)求調(diào)劑 +6 | 0ok0k 2026-03-07 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿武漢理工085601，初試301分，請(qǐng)問能調(diào)劑到湖北嗎 +3 | 肖yang 2026-03-06 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 2026調(diào)劑】考試A區(qū)0703化學(xué)類323分 誠(chéng)求接收 +3 | 卷柏卷柏 2026-03-05 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 紡織、生物、化學(xué)、材料等專業(yè) +3 | Eember. 2026-03-05 | 7/350 |
|