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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 生物科學 » 細胞科學 » 細胞免疫熒光
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科研戰(zhàn)神·王鐵蟲 (小有名氣)
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細胞免疫熒光
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細胞免疫熒光，看完必會！ 一、免疫熒光技術 免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。 用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術。 該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。 二、細胞免疫熒光 主要應用于細胞內(nèi)抗原抗體檢測，適用于細胞水平實驗。 1、直接法 將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。 2、間接法（較為常用） 如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。 操作步驟（以檢測細胞內(nèi)病毒抗原為例） （1）倒出培養(yǎng)液。 （2）潤洗，將1ml SD完全培養(yǎng)基沿培養(yǎng)板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側(cè)壁吸出潤洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。 （3）吹打，加入2ml SD完全培養(yǎng)基，打在培養(yǎng)板底部，然后反復抽打，直至培養(yǎng)板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该�。（吹打之后放置，后使用之前都要反復吹打�? （4）將細胞爬片放入24孔板，每孔一個（注意每個孔只放一個，不要多放，注意檢查）。 （5）往（3）中吹打后的細胞液中繼續(xù)加4ml的SD完全培養(yǎng)基（即總計6ml）。將細胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細胞沉降而造成的不均勻），每個板500ul。注意事項：每一步打開細胞培養(yǎng)時，防止細胞培養(yǎng)板蓋時勿使細胞培養(yǎng)板蓋朝上放置。 （6）在將細胞培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱之前，請噴酒精。 （7）細胞培養(yǎng)24小時之內(nèi)使用，最好20小時。沿側(cè)壁吸出培養(yǎng)液。1PBS潤洗2次，沿側(cè)壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側(cè)壁吸出。 （8）Pfu number/細胞數(shù)=pfuV/細胞數(shù)=感染復數(shù) 感染復數(shù)為2，加病毒20ul + 480ul SD培養(yǎng)液 感染復數(shù)為15，加病毒150ul + 480ul SD培養(yǎng)液 病毒滴數(shù)經(jīng)提前測定為1*10-7pfu/ml （9）先加SD培養(yǎng)基再加病毒。（24h或48h之后進行（10）） （10）固定細胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。 （11）PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。 （12）細胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為Triton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。 （13）封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween) BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。 （14）一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說明書）稀釋，300ul/孔，4攝氏度過夜。 （15）PBST（Tween）洗3次，10min/次 。 （16）二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋，300ul/孔，室溫避光1h。 （17）PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。 （18）PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。 （19）載玻片上滴加封片液，細胞爬片的細胞層與封片液接觸。 （20）熒光共聚焦顯微鏡觀察。 |
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