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Western Blot 如何選擇合適的內參？
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有些人提取蛋白會選擇胞漿、胞核分開提取，不提取總蛋白。β-actin在胞漿中表達高效穩(wěn)定，而總蛋白主要成分就是胞漿蛋白，所以β-actin可以作為總蛋白的內參。理論上細胞核內不表達β-actin，所以不能用于核蛋白內參。同理，細胞核內的蛋白用于做總蛋白內參，自然也不合理，內參自當選擇與目的蛋白表達部位相同的蛋白才能有說服力。 而實際情況中，無論什么試劑盒，都不可能完全將胞漿、胞核蛋白完全分離開，提取時總會有交叉污染。即提取的核蛋白肯定會有β-actin，而胞漿蛋白也會有核蛋白的存在，所以你用兩種蛋白做內參都能有結果，只是有的科學合理，有的不科學，沒有說服力。 此外很多公司的內參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的β-actin為例，有的公司選擇N端，有的選擇C端。選用N端的抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C端的抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內參時產生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。 那么應該如何選擇合適的內參呢，一般遵循以下原則： 1、樣本種屬來源 首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種。哺乳動物的組織或者細胞樣本，通常選擇β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物來源實驗樣本則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來源樣本研究較少，所以就應該參照文獻報道，選擇合適的蛋白作為內參。 2、目的蛋白分子量 選擇內參抗體時，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測目的蛋白分子量為45KD，此時不適宜選擇β-actin（42KD）作為內參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內參。 3、目的蛋白表達部位 a、胞漿和全細胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； e、線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 4、實際的實驗環(huán)境 有些細胞在某些條件下內參表達會出現(xiàn)異常，使其不適合做內參。比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內參。在加入抗癌和抗真菌藥物時，Tubulin的表達易受影響，不適合作為內參。Lamin B不適合作為胚胎干細胞的內參，而PCNA不適合作為非增殖細胞的內參等。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現(xiàn)異常，應考慮這方面因素。 5、不同的組織特異性 actin 即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論。 |
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