 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 895 | 回復(fù): 0 | |||
科研小努力新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
Western Blot 如何選擇合適的內(nèi)參？
|
|
有些人提取蛋白會(huì)選擇胞漿、胞核分開提取，不提取總蛋白。β-actin在胞漿中表達(dá)高效穩(wěn)定，而總蛋白主要成分就是胞漿蛋白，所以β-actin可以作為總蛋白的內(nèi)參。理論上細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá)β-actin，所以不能用于核蛋白內(nèi)參。同理，細(xì)胞核內(nèi)的蛋白用于做總蛋白內(nèi)參，自然也不合理，內(nèi)參自當(dāng)選擇與目的蛋白表達(dá)部位相同的蛋白才能有說(shuō)服力。 而實(shí)際情況中，無(wú)論什么試劑盒，都不可能完全將胞漿、胞核蛋白完全分離開，提取時(shí)總會(huì)有交叉污染。即提取的核蛋白肯定會(huì)有β-actin，而胞漿蛋白也會(huì)有核蛋白的存在，所以你用兩種蛋白做內(nèi)參都能有結(jié)果，只是有的科學(xué)合理，有的不科學(xué)，沒(méi)有說(shuō)服力。 此外很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的β-actin為例，有的公司選擇N端，有的選擇C端。選用N端的抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C端的抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對(duì)造成的。 那么應(yīng)該如何選擇合適的內(nèi)參呢，一般遵循以下原則： 1、樣本種屬來(lái)源 首先要考慮的就是實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于什么物種。哺乳動(dòng)物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物來(lái)源實(shí)驗(yàn)樣本則可以選擇Plant actin、Rubisco等。其他來(lái)源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報(bào)道，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。 2、目的蛋白分子量 選擇內(nèi)參抗體時(shí)，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。比如檢測(cè)目的蛋白分子量為45KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin（42KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內(nèi)參。 3、目的蛋白表達(dá)部位 a、胞漿和全細(xì)胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等； b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等； c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等； d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等； e、線粒體蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。 4、實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境 有些細(xì)胞在某些條件下內(nèi)參表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常，使其不適合做內(nèi)參。比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，Lamin等也不適合作為內(nèi)參。在加入抗癌和抗真菌藥物時(shí)，Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)參。Lamin B不適合作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參，而PCNA不適合作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素。 5、不同的組織特異性 actin 即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
0856材料與化工，270求調(diào)劑
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
085600 材料與化工 298
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
312求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
320材料與化工，求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
成果系統(tǒng)訪問(wèn)量大，請(qǐng)15分鐘后再嘗試。由此給您造成的不便，敬請(qǐng)諒解。
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
281求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
347求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
一志愿314求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研小努力 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿西工大材料學(xué)，英一數(shù)二總分321分，求調(diào)劑。 +3 | zz05zz 2026-03-02 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | 杰尼龜aaa 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境工程學(xué)碩288求助調(diào)劑 +7 | 多吃億口芝士 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085700資環(huán)求調(diào)劑，初始279，六級(jí)已過(guò)，英語(yǔ)能力強(qiáng) +3 | 085700資環(huán)調(diào)劑 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[碩博家園] 2025屆雙非化工碩士畢業(yè)，申博 +4 | 更多的是 2026-02-27 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 沒(méi)有青基直接申請(qǐng)面上，感覺自己瘋了 +5 | kevin63t 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +10 | 簡(jiǎn)單點(diǎn)0 2026-03-02 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 281電子信息求調(diào)劑 +3 | jhtfeybgj 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0857調(diào)劑 +6 | 一ll半 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 考研復(fù)試調(diào)劑，過(guò)國(guó)家線的同學(xué)都可報(bào)名 +7 | 黑！在干嘛 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 290分材料工程085601求調(diào)劑 數(shù)二英一 +8 | llx0610 2026-03-02 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +7 | 明遠(yuǎn)求學(xué) 2026-03-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 今夏不夏 2026-03-01 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +7 | yhk_819 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)調(diào)劑 +10 | 提神豆沙包 2026-02-28 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +3 | Y墨明棋妙Y 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | 曼殊2266 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 317一志愿華南理工電氣工程求調(diào)劑 +6 | Soliloquy_Q 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +4 | 73372112 2026-02-28 | 6/300 |
|