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湖北普美生物科?/a>新蟲 (初入文壇)
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WB常見問題分析
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WB常見問題分析 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB  是很常規(guī)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。不過真正在實(shí)驗(yàn)室里做實(shí)驗(yàn)的小伙伴恐怕都遇到過各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完美的狀況，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案。下面我們列舉一些常見問題一個(gè)個(gè)分析。1.膠片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。 1）二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光； 2）ECL底物中H2O2不穩(wěn)定，失活； 3） ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置； 4）一抗選擇不當(dāng)； 5） 二抗失活。 2.蛋白條帶位置（大�。┎粚φφ�？ 答：可能的原因有： 1)膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度 2)抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間 3）酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定 5）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對照比對結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量 3.有很多雜帶咋回事？ 答：可能的原因有： 1）目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白實(shí)際大小 2) 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時(shí)在冰上操作 3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白 4）抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體 5）抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間 6）二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物 7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 8）底物顯色與曝光時(shí)間過長，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間 4.背景有黑色斑點(diǎn)或有不均勻的白色斑點(diǎn)以及暗背景上白色帶 答：可能的原因有： 1）抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑 2）HRP含量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度 3）HRP偶聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體 4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床 5.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？ 答：可能的原因有： 1）細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞； 2）抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題； 3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長； 4）細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性。 6.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？ 答：1）可以加大抗原上樣量，這是最主要的； 2）也可以將一抗稀釋比例降低； 3）還可以延長曝光時(shí)間。 7.我做的蛋白質(zhì)分子量很�。�10KD），請問怎么做WB？ 答：1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系； 2）也可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。 8.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？ 答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。 |
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