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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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[交流]
細胞實驗 | 脂肪組織中分離巨噬細胞
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01、分離 •用PBS清洗脂肪組織，并將組織放在冰上的培養(yǎng)皿中，用剪刀將組織切成小塊（約3-5mm）。 •將切碎的組織轉(zhuǎn)移到含有7ml冰冷消化緩沖液的10ml圓底管中，此操作需一直保持在冰上。對于>1g的脂肪，將組織切碎并轉(zhuǎn)移到含有10ml冰冷消化緩沖液的50ml錐形管中。 •加入1ml（如脂肪組織重量>1g則可以增加至1.5ml）10× 膠原酶緩沖液，并加入消化緩沖液使得膠原酶的最終濃度為1mg/ml。 •在37°C下孵育半小時，且使試管劇烈搖晃。每10分鐘大力搖動試管，可獲得更高的細胞產(chǎn)量。30分鐘后，取10µl產(chǎn)物進行顯微鏡觀察，此時，脂肪細胞應(yīng)顯示為大的單細胞，白細胞和其他基質(zhì)細胞會小得多。如果白細胞仍附著在脂肪細胞上，則應(yīng)繼續(xù)消化；如果沒有，請繼續(xù)下一步。 •消化后，將EDTA添加到10 mM的最終濃度，并在37°C下再孵育10分鐘。 02、過濾 •用 PBS預(yù)濕100 µm尼龍過濾器，然后放置在50ml錐形管上。使用移液管，將前述樣本的細胞沉淀先轉(zhuǎn)移到過濾器上過濾，然后再過濾含有脂肪細胞的上層。 •加入10 ml FACS 緩沖液輕輕清洗過濾器兩次。 03、離心 •在4 °C下以500×g 離心10分鐘以分離脂肪細胞和巨噬細胞。離心后，脂肪細胞在頂部形成白色層，而巨噬細胞等其它細胞在管底部形成紅色或白色沉淀。 •輕輕吸出并丟棄脂肪細胞和上清液。此時，含有巨噬細胞的團塊很容易受到干擾，因此應(yīng)格外小心。 04、獲取巨噬細胞 •通過輕彈試管將沉淀重懸于0.5 ml紅細胞裂解液中。在室溫下孵育5分鐘，偶爾輕輕搖晃。 •通過添加5 ml FACS緩沖液，中和紅細胞裂解作用。 •在4 °C下以500×g 離心10分鐘。 •在3–5 ml FACS緩沖液中重懸細胞沉淀并在冰上孵育。 05、巨噬細胞計數(shù) •將10 µl每個樣品1:1與臺盼藍溶液混合。使用血細胞計數(shù)板仔細計數(shù)活細胞。根據(jù)計數(shù)得到的細胞數(shù)量，結(jié)合獲得的樣本總體積，可計算出每份脂肪組織巨噬細胞產(chǎn)量。典型的產(chǎn)量：瘦小鼠一般為1-3×1000000個細胞/g脂肪，肥胖小鼠一般為2-5×1000000個細胞/g脂肪。 |
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