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湖北普美生物科?/a>新蟲 (初入文壇)
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一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）實(shí)驗(yàn)步驟
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一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）實(shí)驗(yàn)步驟 自備儀器耗材： 1)試劑 PBS（含1%BSA） 緩沖液( pH7.2～7.4)， 目的是減少離心造成的細(xì)胞損失。 2)儀器 流式細(xì)胞儀、離心機(jī)。 對(duì)照設(shè)置： 陰性對(duì)照：排除細(xì)胞本底、藥物處理等原因產(chǎn)生熒光背景以及非特異性染色造成的影響。準(zhǔn)備一組細(xì)胞作為陰性對(duì)照， 第8步標(biāo)記工作液配制時(shí)不添加TdT酶，其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。 實(shí)驗(yàn)步驟 1.收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組取1×106個(gè)細(xì)胞，300×g離心5min，棄上清。 注：若樣本為貼壁細(xì)胞，凋亡細(xì)胞會(huì)有部分懸浮于上清中，上清中的細(xì)胞也要收集。 2.加入200μLPBS（含1%BSA）重懸細(xì)胞，加入200uL Fixation Buffer，室溫固定60min（推薦使用搖轉(zhuǎn)方式，或每15min 混勻一次）。 3.加入1mL PBS（含1%BSA），600×g 離心5min，棄上清。 4.加入200uL Permeabilization Buffer，冰上破膜10min。 注：破膜溫度過(guò)高或者時(shí)間過(guò)久會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，因此建議Permeabilization Buffer解凍后放置在4℃ , 待使用前取出 ; 另外破膜時(shí)間最長(zhǎng)不要超過(guò)15min。 5.加入1-2mL PBS（含1%BSA）終止破膜，輕輕吹打混勻后，600×g離心5min，棄上清。 6.加入200uL TdT Equilibration Buffer，輕輕吹打混勻，37 °C 平衡15min。 7.600×g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。 8.按照分組參考下表配制標(biāo)記工作液，每個(gè)樣本加入100uL反應(yīng)液（充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用）。 組分 檢測(cè)樣本 陰性對(duì)照 TdT Equilibration Buffer 70ul 80ul Labeling Solution 20ul 20ul TdT Enzyme 10ul 0ul 注： ①TdT Equilibration Buffer使用前，室溫靜置直至完全溶解。冰凍的平衡液融化后可能會(huì)出現(xiàn)鈷鹽結(jié)晶，此為正常現(xiàn) 象。使用前渦旋混勻。 ②Labeling Solution使用前，請(qǐng)置于冰上溶解，待完全溶解后離心，用槍頭吹打混勻。 ③TdT酶對(duì)溫度較敏感，請(qǐng)嚴(yán)格保存于-20℃ , 使用前取出，使用后立即放回。 ④配制標(biāo)記工作液時(shí)，建議不要渦旋。 9.37℃避光孵育60min（每20min輕輕搖晃混勻細(xì)胞） 。 10.加入1mL Stop Solution輕輕吹打混勻，室溫靜置5min，加入300 500uL PBS(含1%BSA)，600×g 離心5min，棄上清。 11.加入200uL PBS（含1%BSA）重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。 (為避免熒光淬滅，請(qǐng)盡快上機(jī)檢測(cè)) 注意事項(xiàng)： 1.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。 2.為了您的安全和健康，操作時(shí)必須戴口罩、手套、實(shí)驗(yàn)服和其它生化實(shí)驗(yàn)室防護(hù)措施。。 3.用于該試劑盒的檢測(cè)樣本最低細(xì)胞數(shù)目不低于5×105個(gè)。 4.實(shí)驗(yàn)中需要重懸細(xì)胞的步驟，用移液器輕輕吹打細(xì)胞10-20次，吹打時(shí)請(qǐng)勿將槍頭中的液體完全吹出，避免造成細(xì)胞損 傷和產(chǎn)生過(guò)多的氣泡。 5.離心去上清的操作要小心謹(jǐn)慎，避免造成細(xì)胞損失。 6.Labeling Solution 和TdT酶應(yīng)避免反復(fù)凍融和渦旋操作。 |
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