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有絲分裂的實(shí)驗(yàn)步驟
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實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo) 1、初步掌握制作根尖細(xì)胞有絲分裂裝片的技術(shù)。 2、觀察植物細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程，識(shí)別分裂的不同時(shí)期。 3、初步掌握繪制生物圖的方法。 實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞的有絲分裂是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程，但可以通過(guò)它的形態(tài)變化，特別是細(xì)胞核中的染色體行為，人為地劃分階段，并進(jìn)行比較研究。在自然狀態(tài)下，一大群處于各個(gè)分裂期的細(xì)胞混雜在一起。必須仔細(xì)觀察，尋找有絲分裂過(guò)程各期典型形態(tài)特征的細(xì)胞，從而建立起細(xì)胞周期的概念。 植物的分生組織（如根尖分生區(qū)、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)等）細(xì)胞，能夠通過(guò)有絲分裂增加其數(shù)目。依據(jù)植物細(xì)胞分裂周期中各個(gè)時(shí)期細(xì)胞中染色質(zhì)或染色體的形態(tài)、數(shù)目、位置變化，確定該細(xì)胞所處的時(shí)期。為了看清染色體或染色質(zhì)，要用堿性染料將其染色。 實(shí)驗(yàn)材料 蠶豆、蒜和蔥的根尖分生區(qū)組織。 試劑儀器 洋蔥鱗莖，鑷子，刀片，培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，滴管，紗布，吸水紙，酒精燈，顯微鏡；固定液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的鹽酸，醋酸洋紅染液，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇。 方法步驟 1、洋蔥根尖的培養(yǎng) （1）培養(yǎng)洋蔥生根時(shí)，避免用新采收的洋蔥，因它尚在休眠不易生根。如果必須用當(dāng)年剛采收的新洋蔥培養(yǎng)生根，則應(yīng)設(shè)法打破它的休眠。常用的方法是用低濃度的赤霉素溶液浸泡洋蔥底盤(pán)，這樣可以促使其生根。培養(yǎng)過(guò)程中，注意每天至少換水一次，以防爛根。 （2）對(duì)于頭年收下的洋蔥，可以采用如下方法促使它生根： ①選擇底盤(pán)大的洋蔥作生根材料。 ②剝?nèi)ネ鈱永掀�，用刀削去老根（從底盤(pán)中央向四周削），注意不要削掉四周的“根芽”。 ③用燒杯裝滿清水，放上洋蔥，放置在光照處。水要保持清潔，注意每天換水1～2次。一般2～3d即可獲得實(shí)驗(yàn)所需材料（根長(zhǎng)5cm）。 （3）固定時(shí)間取材。洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的時(shí)間是有規(guī)律的。通常在每天上午10時(shí)至下午2時(shí)分裂活躍，尤其以下午2時(shí)最活躍，可在這時(shí)取材�？梢园雅囵B(yǎng)好的洋蔥根用卡洛氏固定液固定起來(lái)備用。因?yàn)榕囵B(yǎng)一次洋蔥根不容易。 2、解離。用刀片切下長(zhǎng)約2～3mm的根尖，放入盛有15%鹽酸和體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液的混合液（1︰1）的培養(yǎng)皿中，解離3～5min，使根尖組織的細(xì)胞相互分開(kāi)，待根尖透明酥軟即停止解離。如果要使解離加快，可以把培養(yǎng)皿放在酒精燈上微微加熱（不可煮沸）3～5min。待根酥軟后，用鑷子取出。 解離充分是實(shí)驗(yàn)成功的必備條件；解離的目的是用藥液溶解細(xì)胞間質(zhì)，使組織細(xì)胞相互分離開(kāi)。 3、漂洗。把取出的根尖放入清水漂洗約10min，也可以在培養(yǎng)皿口上蒙上—層紗布，用自來(lái)水細(xì)小的水流漂洗3～5min。 漂洗的目的是洗去根中多余的解離液。如果不把多余的解離液洗去，一方面會(huì)影響染色效果，因?yàn)榻怆x液中含有HCl溶液，而用來(lái)染色的染料呈堿性；另一方面還會(huì)腐蝕顯微鏡的鏡頭。 4、染色。把漂洗好的根尖置于載玻片上，用鑷子頭截下長(zhǎng)約3mm的根尖，其余部分丟棄，在根尖上滴一滴醋酸洋紅染液染色3～5min，如果要使染色加快，可把載玻片在酒精燈的火焰上快速過(guò)幾下（不可煮沸）。 5、裝片。在染好色的材料上蓋上蓋玻片，上面再覆一片載玻片，用拇指輕輕壓一下，使根尖組織成為均勻薄層的細(xì)胞層。 6、鏡檢 （1）低倍鏡觀察 把制成的洋蔥根尖裝片先放在低倍鏡下觀察，慢慢移動(dòng)裝片，找到分生區(qū)細(xì)胞，其特點(diǎn)是：細(xì)胞呈正方形，排列緊密，有的細(xì)胞正在分裂。 （2）高倍鏡觀察 找到分生區(qū)細(xì)胞后，把低倍鏡移走，換上高倍鏡，用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋和反光鏡把視野調(diào)整清晰，直到看清細(xì)胞物像為止。 （3）仔細(xì)觀察 仔細(xì)觀察的目的是區(qū)分細(xì)胞分裂中各個(gè)時(shí)期內(nèi)染色體變化的特點(diǎn)。可先找出處于細(xì)胞分裂中期的細(xì)胞，然后再找出前期、后期、末期的細(xì)胞，處于間期的細(xì)胞數(shù)目最多，最容易找到。 （4）在一個(gè)視野里，往往不容易找全有絲分裂過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞。如果是這樣，可以慢慢地移動(dòng)裝片，從鄰近的分生區(qū)細(xì)胞中尋找。 7、繪圖。在仔細(xì)觀察清楚有絲分裂各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞的以后，繪出洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂的簡(jiǎn)圖。 注意事項(xiàng) 1、培養(yǎng)產(chǎn)生洋蔥根尖的材料是洋蔥鱗莖。鱗莖底部接觸水，不能離開(kāi)水，也不能被水淹。其目的是同時(shí)滿足其對(duì)水和空氣的需要。同時(shí)要經(jīng)常換水，因?yàn)樗杏捎谖⑸锏幕顒?dòng)和根細(xì)胞的活動(dòng)，代謝產(chǎn)物增多；此外，還由于根細(xì)胞的呼吸不斷產(chǎn)生CO2，使水中H2CO3增多，氧氣缺少；微生物，如細(xì)菌的大量繁殖也使水質(zhì)受到污染，這些都不利于根尖生長(zhǎng)，所以要經(jīng)常換水。一般一天至少一次，還要提供適宜的溫度。 2、剪取洋蔥根尖材料時(shí)，應(yīng)該在洋蔥一天之中分裂最活躍的時(shí)間，一般在上午11點(diǎn)左右。如果因氣溫影響或不在—上述時(shí)間做實(shí)驗(yàn)的話，可以在細(xì)胞有絲分裂最盛時(shí)取材，放人盛有固定液的培養(yǎng)皿中固定，即浸泡半天到一天。固定后用75%乙醇沖洗幾次，再放入盛有70%乙醇的小廣口瓶中保存。注意要等根尖長(zhǎng)到1～5cm時(shí)才能切取，而切取的洋蔥根尖長(zhǎng)度是2～3mm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知，根長(zhǎng)到1～5cm時(shí)，根的長(zhǎng)勢(shì)最佳，此時(shí)細(xì)胞分裂最旺盛，容易找到不同時(shí)期的分裂圖像。此時(shí)可取生長(zhǎng)健壯的根進(jìn)行觀察，切取洋蔥根尖2～3mm，這個(gè)長(zhǎng)度要從根的頂端（根冠）開(kāi)始算起，這個(gè)長(zhǎng)度已將分生區(qū)包括了進(jìn)來(lái)。若取材過(guò)長(zhǎng)，在低倍鏡下尋找分生區(qū)就會(huì)很困難。 3、根尖培養(yǎng)好以后，裝片制作是否成功，關(guān)鍵的步驟是解離。15%的鹽酸溶液能溶解細(xì)胞壁之間的中層物質(zhì)（胞間質(zhì)），使組織中的細(xì)胞相互分開(kāi)。否則，在顯微鏡下觀察時(shí)，細(xì)胞將發(fā)生重疊現(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。解離不充分，細(xì)胞重疊；解離過(guò)度，細(xì)胞會(huì)腐爛，所以解離要適度。為達(dá)到這一目的，配制的鹽酸濃度要適宜，切取的根尖應(yīng)立即放入15%的鹽酸中，在室溫下解離10～15min。解離時(shí)間要視室內(nèi)溫度而定，溫度低，時(shí)間稍長(zhǎng)，溫度高，時(shí)間短。也可手拿鑷子，輕輕按正在解離的根尖，感覺(jué)酥軟即可。 4、漂洗的目的是洗去根中多余的解離液。如果不把多余的解離液洗去，一方面會(huì)影響染色效果，因?yàn)榻怆x液中含HCl，而用染色的染料呈堿性；另一方面還會(huì)腐蝕顯微鏡的鏡頭。 5、染色時(shí)，染色液的濃度和染色時(shí)間必須掌握好。特別是染色不能過(guò)深，否則鏡下一片紫色，無(wú)法觀察。也不能過(guò)淺，否則染色質(zhì)和染色體的形態(tài)和數(shù)目不易辨清。 6、制片時(shí)，一方面要用鑷子把洋蔥根尖弄碎，另一方面要壓片，這樣可以使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)。壓片時(shí)，在蓋玻片上再加一片載玻片的目的，一是避免壓碎和移動(dòng)蓋玻片。二是使壓力大小適中，從而使組織細(xì)胞均勻分散。同時(shí)用力必須恰當(dāng)，過(guò)重時(shí)會(huì)將組織壓爛，過(guò)輕則細(xì)胞未分散開(kāi)，二者都將影響觀察。 7、結(jié)果與討論 在顯微鏡的一個(gè)視野中看到的細(xì)胞，多數(shù)處于細(xì)胞有絲分裂的間期，因?yàn)樵谝粋�(gè)細(xì)胞周期中，間期所占的時(shí)間占整個(gè)細(xì)胞周期的90%～95%，時(shí)間與細(xì)胞數(shù)目成正比。另外，在一個(gè)視野中，往往不容易找全有絲分裂過(guò)程中各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞，可以慢慢地移動(dòng)裝片，從鄰近的分生區(qū)細(xì)胞中尋找。 作者：畢合生物 公眾號(hào)：畢合生物 畢合生物（www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫(kù)與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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