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木蟲之王 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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較為理想的熔解曲線是單峰曲線，如出現(xiàn)多峰有以下原因： 1）非特異性擴(kuò)增：主要原因?yàn)橐锾禺愋圆缓�、Tm值較低或模板質(zhì)量不高，可以根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)新引物或者通過(guò)梯度 PCR 對(duì)引物退火溫度（Tm值）進(jìn)行優(yōu)化，上調(diào)Tm值，選購(gòu)質(zhì)量較好的離心柱法核酸提取試劑，提高核酸提取質(zhì)量，等等。 2）引物二聚體 可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于100 bp以下。引物二聚體在熔解曲線內(nèi)峰值一般位于75℃左右，如該峰顯著請(qǐng)按照以下方面進(jìn)行優(yōu)化： A.優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由 95℃變性步驟直接進(jìn)入 60℃退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60℃。 B.引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為200 nM，但如有需要，可將濃度降至60nM。 C.cDNA模板帶有基因組DNA污染：重新制備cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase對(duì)RNA進(jìn)行處理，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 如果排除以上原因還是出現(xiàn)熔解曲線多峰的情況，就要考慮及時(shí)更換試劑盒，避免耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。 |
2樓2023-07-23 17:38:23
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