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流式熒光崔新蟲 (初入文壇)
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[交流]
重組蛋白上已經(jīng)有巰基了，可以直接加入SMCC活化的熒光染料進行交聯(lián)嗎？ 已有1人參與
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大家好，我是流式熒光崔工，一個旨在鏈接與流式熒光相關(guān)的朋友，一起賺錢、一起學(xué)習(xí)、一起工作、一起生活的靚仔。 上一篇文章制作PE-Cy7串聯(lián)染料時，Cy7是和PE上的什么基團連接的？ 回到了一位老師購買崔工家染料時咨詢的問題。 大家剛開始接觸PE時，可能都會有這樣的誤解。 PE上的氨基都已經(jīng)跟Cy7反應(yīng)了，SMCC還怎么跟PE上的氨基連接呢。 答案就是PE上的氨基太多了，有70多個，Cy7只有部分跟PE反應(yīng)了而已，剩下的是可以再和SMCC反應(yīng)的。 今天有位老師找崔工聊天。 老師問：崔工你們有做過重組蛋白的熒光標記嘛？ 這個問題有點大，問的崔工都不知道怎么回答，回答做過，重組蛋白那么多，染料也那么多，萬一老師問的剛好是我們沒有做過的就尷尬了。 如果回答沒有做過，但我們又幫客戶標記過。 所以崔工只能反問到，你具體指的是給重組蛋白標記什么熒光染料呢？ 老師說：我們想給重組蛋白標記PE、APC等染料。之前有試過用這些染料去標記多肽，但是效果不是很好，交聯(lián)效率很低，去做流式檢測時基本上都是陰性的。 崔工問，你的多肽或者蛋白有氨基或者賴氨酸殘基沒？ 只要你的多肽或者蛋白有氨基或者賴氨酸殘基中的一個就可以標記的。 老師聽后疑惑的問道：PE或者APC不是和SMCC反應(yīng)之后就和巰基反應(yīng)么？這樣多肽或者蛋白上是要有巰基啊，怎么會需要氨基或者巰基呢？ 崔工說，是的，我們常用的方法是用DPDP跟抗體、蛋白、多肽上是氨基反應(yīng)產(chǎn)生二硫鍵，再用TCEP去切除產(chǎn)生巰基，巰基與SMCC反應(yīng)，最后讓抗體、蛋白、多肽帶上熒光。 當然也有老師是直接用DTT去打開抗體的二硫鍵的方法。 崔工在以前的文章中講過，不建議這樣做，不清楚的可以翻看前面的文章，也可以聯(lián)系崔工問我。 老師你說的多肽上已經(jīng)有巰基了，用SMCC活化的染料去交聯(lián)后上流式卻沒有熒光。 你需要了解下，這里有幾個問題。 第一巰基最少要5-6個，只有有多個巰基才行。 第二，你得到重組含有巰基的蛋白需要快速交聯(lián)，否則巰基之間是很容易形成二硫鍵的，這樣你肯定交聯(lián)不上。 你確定這個沒有問題的話，最后肯定是有信號的。 如果不確定的話，最好還是用SPDP的方法。 今天的文章就分享到這，如果今天的文章對您有一點點幫忙或一絲絲的啟發(fā)，歡迎幫忙點個在看和轉(zhuǎn)發(fā)，也可加崔工微信進一步交流溝通。 |
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Gyeler
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 電化學(xué)
2樓2025-06-10 14:03:53
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