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流式熒光崔新蟲 (初入文壇)
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[交流]
重組蛋白上已經(jīng)有巰基了，可以直接加入SMCC活化的熒光染料進(jìn)行交聯(lián)嗎？ 已有1人參與
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大家好，我是流式熒光崔工，一個(gè)旨在鏈接與流式熒光相關(guān)的朋友，一起賺錢、一起學(xué)習(xí)、一起工作、一起生活的靚仔。 上一篇文章制作PE-Cy7串聯(lián)染料時(shí)，Cy7是和PE上的什么基團(tuán)連接的？ 回到了一位老師購買崔工家染料時(shí)咨詢的問題。 大家剛開始接觸PE時(shí)，可能都會(huì)有這樣的誤解。 PE上的氨基都已經(jīng)跟Cy7反應(yīng)了，SMCC還怎么跟PE上的氨基連接呢。 答案就是PE上的氨基太多了，有70多個(gè)，Cy7只有部分跟PE反應(yīng)了而已，剩下的是可以再和SMCC反應(yīng)的。 今天有位老師找崔工聊天。 老師問：崔工你們有做過重組蛋白的熒光標(biāo)記嘛？ 這個(gè)問題有點(diǎn)大，問的崔工都不知道怎么回答，回答做過，重組蛋白那么多，染料也那么多，萬一老師問的剛好是我們沒有做過的就尷尬了。 如果回答沒有做過，但我們又幫客戶標(biāo)記過。 所以崔工只能反問到，你具體指的是給重組蛋白標(biāo)記什么熒光染料呢？ 老師說：我們想給重組蛋白標(biāo)記PE、APC等染料。之前有試過用這些染料去標(biāo)記多肽，但是效果不是很好，交聯(lián)效率很低，去做流式檢測(cè)時(shí)基本上都是陰性的。 崔工問，你的多肽或者蛋白有氨基或者賴氨酸殘基沒？ 只要你的多肽或者蛋白有氨基或者賴氨酸殘基中的一個(gè)就可以標(biāo)記的。 老師聽后疑惑的問道：PE或者APC不是和SMCC反應(yīng)之后就和巰基反應(yīng)么？這樣多肽或者蛋白上是要有巰基啊，怎么會(huì)需要氨基或者巰基呢？ 崔工說，是的，我們常用的方法是用DPDP跟抗體、蛋白、多肽上是氨基反應(yīng)產(chǎn)生二硫鍵，再用TCEP去切除產(chǎn)生巰基，巰基與SMCC反應(yīng)，最后讓抗體、蛋白、多肽帶上熒光。 當(dāng)然也有老師是直接用DTT去打開抗體的二硫鍵的方法。 崔工在以前的文章中講過，不建議這樣做，不清楚的可以翻看前面的文章，也可以聯(lián)系崔工問我。 老師你說的多肽上已經(jīng)有巰基了，用SMCC活化的染料去交聯(lián)后上流式卻沒有熒光。 你需要了解下，這里有幾個(gè)問題。 第一巰基最少要5-6個(gè)，只有有多個(gè)巰基才行。 第二，你得到重組含有巰基的蛋白需要快速交聯(lián)，否則巰基之間是很容易形成二硫鍵的，這樣你肯定交聯(lián)不上。 你確定這個(gè)沒有問題的話，最后肯定是有信號(hào)的。 如果不確定的話，最好還是用SPDP的方法。 今天的文章就分享到這，如果今天的文章對(duì)您有一點(diǎn)點(diǎn)幫忙或一絲絲的啟發(fā)，歡迎幫忙點(diǎn)個(gè)在看和轉(zhuǎn)發(fā)，也可加崔工微信進(jìn)一步交流溝通。 |
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Gyeler
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2樓2025-06-10 14:03:53
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