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正常視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
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實(shí)驗(yàn)材料： 1. 材料來源：人眼、兔眼或者豬眼等； 2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7. 3. 特殊取材器械：眼球托與7-0尼龍線。以滅菌的白色橡膠反口膠塞作為眼球托； 4. 消毒液：200IU/ml的慶大霉素生理鹽水； 5. 消化液：0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液； 6. 培養(yǎng)液：為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液； 7. 培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿若干。 實(shí)驗(yàn)方法： 1. 摘取眼球，用200IU/ml的慶大霉素生理鹽水浸泡消毒5min。沿鋸齒緣后2—3mm處環(huán)形剪開眼球前段，去除角膜、晶狀體以及玻璃體。分離去掉視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。將眼球后段制成眼杯； 2. 將眼杯置于眼球托（可以洗凈消毒過的鹽水瓶膠塞替代）上，取持針器用7-0尼龍線在4個對稱方向上，把眼杯縫合固定在眼球托的壁緣上； 3. 用毛細(xì)吸管輕輕從眼杯中吸出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。以PBS液漂洗眼杯2次，吸干； 4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液，置于無菌的燒杯中。于37℃恒溫箱中消化30min； 5. 吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培養(yǎng)液終止消化酶的作用，并用毛細(xì)吸管輕輕吹打眼杯內(nèi)壁，以使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞脫落； 6. 收集眼杯內(nèi)的細(xì)胞懸液，離心（800r/min）8min； 7. 棄上清液，將沉淀的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞重新用培養(yǎng)液懸浮。計(jì)數(shù)； 8. 以8×104—10×104個/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中； 9. 送人培養(yǎng)箱中，按常規(guī)方法培養(yǎng)，每周換液2次； 10. 也可直接用機(jī)械分離植塊法：用無齒鑷撕下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層，經(jīng)PBS漂洗后，將其剪成1.5mm×1.5mm大小的組織塊，直接接種于24孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。 作者：畢合生物 公眾號：畢合生物 畢合生物提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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