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high_dwarf新蟲 (初入文壇)
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微生物細(xì)胞色素c樣品提取方法 已有1人參與
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- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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一、液體樣本 液體樣本處理原則：所有的液體樣本，用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），如果以后碰到其他的液體樣本，也按這個(gè)方法，納入?yún)R總表。 血液經(jīng)抗凝處理后的全部血液為全血；離心除去血細(xì)胞后所得到的淡黃色液體為血漿。 如血液不經(jīng)抗凝處理，讓其自行凝固，則在抽血后的一段時(shí)間內(nèi)，血液會(huì)自動(dòng)在一系列凝血因子的作用下發(fā)生凝集，血液首先凝固成一個(gè)整體，再經(jīng)過一段時(shí)間或用離心機(jī)離心，血液中凝固的部分會(huì)與一些清澈淡黃色的液體分離開，這些液體稱為血清。 血清與血漿從表面上看似乎沒有什么不同，但其內(nèi)在的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，是未經(jīng)抗凝處理過的血液凝固后得到的。 抽血做化驗(yàn)中常遇到某些化驗(yàn)要求用血清測(cè)定、用全血測(cè)定、用血漿測(cè)定，即是指血液標(biāo)本的三種主要處理方式和要求。 Part.1 血清 用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 Part.2 血漿 應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。 Part.3 尿液 用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 Part.4 胸腹水 用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 Part.5 腦脊液 用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。(（采集大鼠腦脊液）的方法：采集腦脊液時(shí)，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口((1. 5cm左右)，在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開2cm，將皮分離兩側(cè)，擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。注意，有出血時(shí)用干紗布按壓止血，保持術(shù)口清晰。接近頸后黃韌帶時(shí)，小心地用7號(hào)注射針頭分離附蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用lml注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成150度鈍角)，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液，一般采集量為100-200微升。) Part.6 唾液 用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 Part.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清 檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 Part.8 全血 用含有抗凝劑的無菌管收集，立即輕輕搖動(dòng)，來回輕輕顛倒數(shù)次，使血液和抗凝劑混勻，以防血液凝固。 二、固體樣本 固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白，要先收集細(xì)胞，再用合適方法破碎，離心取上清測(cè)試。 Part.1 組織標(biāo)本：用預(yù)冷的PBS (0.01 M.pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑(10mg組織+100微升PBS+10微升蛋白酶抑制劑) )加入玻璃勻漿器中，在冰 上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000xg離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。 Part.2 細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。 1、培養(yǎng)的細(xì)胞：A、動(dòng)物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 B、植物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 2、組織的細(xì)胞：切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。 標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 V我 189-5972-1209 |
2樓2023-05-15 10:10:24
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