 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1632 | 回復(fù): 4 | |||
| 【有獎交流】積極回復(fù)本帖子，參與交流，就有機(jī)會分得作者 合肥肽庫生物 的 1 個金幣 ，回帖就立即獲得 1 個金幣，每人有 1 次機(jī)會 | |||
[交流]
關(guān)于蛋白標(biāo)簽的介紹說明
|
|||
|
蛋白標(biāo)簽（protein tag）是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測、示蹤和純化等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽。由于蛋白標(biāo)簽的不同特性，人們在質(zhì)粒構(gòu)建時常常遇到多種問題，那么今天小編就來談?wù)劦鞍讟?biāo)簽的那些事。 1、在質(zhì)粒構(gòu)建的時候，該選用什么蛋白標(biāo)簽?zāi)兀?br /> 小編建議根據(jù)實驗的目的選擇不同的性質(zhì)蛋白標(biāo)簽，常用的蛋白標(biāo)簽有6xHIS、Flag、GST、c-Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO等。 1）6xHis 圖片 6xHis是指六個組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽（HHHHHH，編號：184961），可插入在目的蛋白的C末端或N末端，用于對重組蛋白進(jìn)行分離純化。His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用。常見的帶6XHis的載體有pET-28a(+)、pET-28b、pET-22b(+)、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pACYC-duet1等 2）Flag標(biāo)簽蛋白 圖片 Flag標(biāo)簽蛋白（DYKDDDDK，編號：133742）應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。常見的帶有Flag標(biāo)簽的載體有pESC-His、pFLAG-CMV2、pENTR4-FLAG等。 3）c-Myc 圖片 C-Myc 標(biāo)簽蛋白（EQKLISEEDL，編號：162694），是一個含11個氨基酸的小標(biāo)簽，這11個氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計量術(shù)中, 可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。常見的載體有pCMV-MYC、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pCMV-RFP-C-Myc、pCMV-Myc等。 4）eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP 分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發(fā)波長發(fā)射波長，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。常見的帶有eGFP的載體有pEGFP-N1、pEGFP-C1、pcDNA3.1-EGFP、pIRES-EGFP等。 5）SUMO SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白，研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，不但可以進(jìn)一步提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。SUMO標(biāo)簽也常用于和其他標(biāo)簽一起應(yīng)用，作為特異酶切水解位點。常見的帶有SUMO標(biāo)簽的載體有pET-SUMO、pET28a-SUMO等。 2、蛋白標(biāo)簽需不需要考慮分子量大小呢？ 理論上說蛋白標(biāo)簽越大，對蛋白質(zhì)本身的功能影響越大，所以大分子標(biāo)簽一般只用于檢測或蛋白純化等。常見的分子量較小的標(biāo)簽有His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag、Myc-Tag，這些標(biāo)簽只有幾個氨基酸，有很多商品化的抗體，用這些Tag主要用來節(jié)省成本，也節(jié)約大家制備單抗所需的時間。而大分子的蛋白標(biāo)簽常見的有SUMO、GFP、GST等。 3、蛋白標(biāo)簽都需要去除嗎？ 一般為了不影響目的蛋白的后續(xù)應(yīng)用，都會選擇一定的方式將表達(dá)時帶上的各種標(biāo)簽去除。所以在設(shè)計構(gòu)建載體時可以在標(biāo)簽蛋白和外源蛋白之間加上蛋白酶識別位點，這樣表達(dá)純化得到融合有標(biāo)簽的目的蛋白后通過蛋白酶切的方式將標(biāo)簽去除，得到完整的目的蛋白。這些常用的蛋白酶位點有：HRV 3C蛋白酶切位點、TEV蛋白酶切位點、腸激酶切位點、SUMO蛋白酶切位點等。但是也有幾點需要說明： 1）這些酶切位點特異性都比較高，但切割效率各不相同； 2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除標(biāo)簽后都會殘留幾個氨基酸殘基。SUMO蛋白酶識別的是SUMO標(biāo)簽的空間結(jié)構(gòu)，然后將這個標(biāo)簽完整切除，不會留下多余的氨基酸殘基； 3）蛋白酶的切割效率也受識別位點附近的氨基酸殘基性質(zhì)的影響，具體可以參見有關(guān)文獻(xiàn)； 4）有些標(biāo)簽比較小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不會對后續(xù)研究和應(yīng)用產(chǎn)生影響，可以不必切除。但是有些大的標(biāo)簽，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO標(biāo)簽等等，還是需要切除的。 4、蛋白標(biāo)簽是加在N端還是C端呢？ N-端或C-端標(biāo)記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。例如對于蛋白太小容易被降解的和比較難表達(dá)的蛋白，可以利用5’端的蛋白標(biāo)簽。這樣既能保證蛋白的穩(wěn)定性，也對外源蛋白的免疫原性影響也很小，該法適用于表位篩選。如果目的蛋白是分泌蛋白，就會遇到在目的蛋白分泌到高爾基體的過程中，蛋白5’端的信號肽，會被酶切掉的問題。這樣，你標(biāo)簽要是裝在5’端，就沒什么用了。 5、C端His標(biāo)簽后未馬上終止對His標(biāo)簽特性會不會有影響？ His分離純化的原理為組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進(jìn)行分離純化，若C端His標(biāo)簽后未添加終止密碼子，多余的氨基酸可能會影響His標(biāo)簽的空間構(gòu)象從而影響其掛壁效果。 參考文獻(xiàn) [1] Carson M , Johnson D H , Mcdonald H , et al. His-tag impact on structure. Acta Crystallographica, 2007, 63(3):295-301. [2] Lichty J J , Malecki J L , Agnew H D , et al. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif, 2005, 41(1):0-105. [3] Kim K I, Baek S H, Chung C H. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. Journal of Cellular Physiology, 2002, 191(3):257–268. [4] Porath J , Carlsson J , Olsson I , et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 1975, 258(5536):598-9. Terpe K. Protein Tags[M]. 2005. [5] Wilkins M R, Gasteiger E, Tonella L, et al. Protein identification with N and C-terminal sequence tags in proteome projects. Journal of Molecular Biology, 1998, 278(3):599-608. |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
研究生招生
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
材料與化工，291，求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
0817一志愿蘇州大學(xué)280復(fù)試調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
求調(diào)劑 一志愿蘇州大學(xué)，0856化工323分 | 本科應(yīng)化 | 有專利/競賽/科研助手經(jīng)歷 |
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
085602化工求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
083000環(huán)境科學(xué)與工程調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
307求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
求材料讀博院校
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
哈工大材料324求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料調(diào)劑，307分
已經(jīng)有10人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 搶金幣啦！回帖就可以得到:
-
廣東工業(yè)大學(xué)-木質(zhì)纖維素高值化利用團(tuán)隊招博士研究生
+1/86
-
鄭州大學(xué)付永柱課題組誠招2026年入學(xué)博士生
+1/86
-
湖北省楚天學(xué)子教授團(tuán)隊招收專碩和學(xué)碩士6名
+5/85
-
澳大利亞皇家墨爾本理工大學(xué)（RMIT）理學(xué)院 院士團(tuán)隊2026招收CSC博士生
+1/37
-
長江大學(xué)武漢校區(qū)石油工程學(xué)院人才招聘-2026
+1/35
-
中國石油大學(xué)（北京）國家級大人才團(tuán)隊博士招生3名：化學(xué)、材料、石油工程：油田化學(xué)
+1/30
-
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所招收1名聯(lián)合培養(yǎng)/客座研究生，碩博皆可
+1/22
-
2026年北京石油化工學(xué)院環(huán)境學(xué)科-水污染控制工程方向課題組歡迎您
+1/19
-
食品科學(xué)與工程083200-297分
+1/19
-
中國科學(xué)院過程工程研究所誠聘博士后，高分子等方向。
+1/17
-
福建師范大學(xué) 院士團(tuán)隊 招2026級博士1名
+1/14
-
香港中文大學(xué)（深圳）管君課題組 微納光學(xué)方向 招收碩士、博士、博士后
+1/8
-
303求調(diào)劑，非常樂意調(diào)劑其他專業(yè)
+1/4
-
復(fù)試可能過不了想調(diào)劑
+1/4
-
【第三輪招生】澳科大誠招2026年秋季碩士研究生（3月31日下午18:00截止）
+1/4
-
2026年東北石油大學(xué)“頁巖油氣鉆采高效井眼清潔”創(chuàng)新團(tuán)隊招碩士生
+1/4
-
計算三階力常數(shù)用thirdorder擴(kuò)胞時參數(shù)如何選擇？臨近原子數(shù)怎么取值
+1/3
-
中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院-寧波諾丁漢大學(xué)2026年聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生招生
+1/3
-
北京大學(xué)環(huán)境學(xué)院張子帥研究員招收科研助理
+1/2
-
澳門理工大學(xué)人工智能藥物發(fā)現(xiàn)中心招收2026級博士研究生（申請-考核制）
+1/1
簡單回復(fù)
nono20092樓
2023-04-04 14:33
回復(fù)
專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
·
tzynew3樓
2023-04-04 21:46
回復(fù)
專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
2023-04-04 22:38
回復(fù)
專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
XG-WUST5樓
2023-04-05 21:03
回復(fù)
專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
up 發(fā)自小木蟲IOS客戶端
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 合肥肽庫生物 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 研究生招生 +3 | 徐海濤11 2026-03-10 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考博] 求材料讀博院校 +9 | yanglei131 2026-03-08 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0817化學(xué)工程319求調(diào)劑 +7 | lv945 2026-03-08 | 9/450 |
|
|
|
[考博] 找博導(dǎo) +4 | 小呆呆熊 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +5 | thext 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考博] 26年博士申請 +4 | 科研狗111 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +7 | ounce. 2026-03-05 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑自薦信，初試323 +4 | 李白26 2026-03-07 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑292分 +3 | 打烊eee 2026-03-07 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 誠求調(diào)劑，323分 有專利/科研/實習(xí)經(jīng)歷 +6 | 橙子cyx 2026-03-06 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿211 085600 280數(shù)二英二求調(diào)劑 +3 | 月山斜 2026-03-06 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | 52hz~~ 2026-03-05 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 哈爾濱理工大學(xué)2026年研究生調(diào)劑，材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院研究生調(diào)劑 +3 | xinliu866 2026-03-06 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)專業(yè)調(diào)劑 +5 | 好好好1233 2026-03-04 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +6 | vuzhdkfjkx 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理085601專碩347分求調(diào)劑 +4 | 啊歐歐歐 2026-03-04 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料085600 303求調(diào)劑 +7 | 1bygone 2026-03-04 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +8 | 26調(diào)劑 2026-03-03 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 我是小小蔥蔥 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|