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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 藥學 » 天然藥物化學 » 關于蛋白標簽的介紹說明
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關于蛋白標簽的介紹說明
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蛋白標簽（protein tag）是指利用DNA體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。隨著技術的不斷發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標簽。由于蛋白標簽的不同特性，人們在質(zhì)粒構建時常常遇到多種問題，那么今天小編就來談談蛋白標簽的那些事。 1、在質(zhì)粒構建的時候，該選用什么蛋白標簽呢？ 小編建議根據(jù)實驗的目的選擇不同的性質(zhì)蛋白標簽，常用的蛋白標簽有6xHIS、Flag、GST、c-Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO等。 1）6xHis 圖片 6xHis是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽（HHHHHH，編號：184961），可插入在目的蛋白的C末端或N末端，用于對重組蛋白進行分離純化。His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用。常見的帶6XHis的載體有pET-28a(+)、pET-28b、pET-22b(+)、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pACYC-duet1等 2）Flag標簽蛋白 圖片 Flag標簽蛋白（DYKDDDDK，編號：133742）應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。常見的帶有Flag標簽的載體有pESC-His、pFLAG-CMV2、pENTR4-FLAG等。 3）c-Myc 圖片 C-Myc 標簽蛋白（EQKLISEEDL，編號：162694），是一個含11個氨基酸的小標簽，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達。常見的載體有pCMV-MYC、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pCMV-RFP-C-Myc、pCMV-Myc等。 4）eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP 分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發(fā)波長發(fā)射波長，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來。常見的帶有eGFP的載體有pEGFP-N1、pEGFP-C1、pcDNA3.1-EGFP、pIRES-EGFP等。 5）SUMO SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白，研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。SUMO標簽也常用于和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點。常見的帶有SUMO標簽的載體有pET-SUMO、pET28a-SUMO等。 2、蛋白標簽需不需要考慮分子量大小呢？ 理論上說蛋白標簽越大，對蛋白質(zhì)本身的功能影響越大，所以大分子標簽一般只用于檢測或蛋白純化等。常見的分子量較小的標簽有His-Tag、Flag-Tag、HA-Tag、Myc-Tag，這些標簽只有幾個氨基酸，有很多商品化的抗體，用這些Tag主要用來節(jié)省成本，也節(jié)約大家制備單抗所需的時間。而大分子的蛋白標簽常見的有SUMO、GFP、GST等。 3、蛋白標簽都需要去除嗎？ 一般為了不影響目的蛋白的后續(xù)應用，都會選擇一定的方式將表達時帶上的各種標簽去除。所以在設計構建載體時可以在標簽蛋白和外源蛋白之間加上蛋白酶識別位點，這樣表達純化得到融合有標簽的目的蛋白后通過蛋白酶切的方式將標簽去除，得到完整的目的蛋白。這些常用的蛋白酶位點有：HRV 3C蛋白酶切位點、TEV蛋白酶切位點、腸激酶切位點、SUMO蛋白酶切位點等。但是也有幾點需要說明： 1）這些酶切位點特異性都比較高，但切割效率各不相同； 2）除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除標簽后都會殘留幾個氨基酸殘基。SUMO蛋白酶識別的是SUMO標簽的空間結(jié)構，然后將這個標簽完整切除，不會留下多余的氨基酸殘基； 3）蛋白酶的切割效率也受識別位點附近的氨基酸殘基性質(zhì)的影響，具體可以參見有關文獻； 4）有些標簽比較小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不會對后續(xù)研究和應用產(chǎn)生影響，可以不必切除。但是有些大的標簽，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO標簽等等，還是需要切除的。 4、蛋白標簽是加在N端還是C端呢？ N-端或C-端標記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構、定位等特性。例如對于蛋白太小容易被降解的和比較難表達的蛋白，可以利用5’端的蛋白標簽。這樣既能保證蛋白的穩(wěn)定性，也對外源蛋白的免疫原性影響也很小，該法適用于表位篩選。如果目的蛋白是分泌蛋白，就會遇到在目的蛋白分泌到高爾基體的過程中，蛋白5’端的信號肽，會被酶切掉的問題。這樣，你標簽要是裝在5’端，就沒什么用了。 5、C端His標簽后未馬上終止對His標簽特性會不會有影響？ His分離純化的原理為組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進行分離純化，若C端His標簽后未添加終止密碼子，多余的氨基酸可能會影響His標簽的空間構象從而影響其掛壁效果。 參考文獻 [1] Carson M , Johnson D H , Mcdonald H , et al. His-tag impact on structure. Acta Crystallographica, 2007, 63(3):295-301. [2] Lichty J J , Malecki J L , Agnew H D , et al. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif, 2005, 41(1):0-105. [3] Kim K I, Baek S H, Chung C H. Versatile protein tag, SUMO: its enzymology and biological function. Journal of Cellular Physiology, 2002, 191(3):257–268. [4] Porath J , Carlsson J , Olsson I , et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature, 1975, 258(5536):598-9. Terpe K. Protein Tags[M]. 2005. [5] Wilkins M R, Gasteiger E, Tonella L, et al. Protein identification with N and C-terminal sequence tags in proteome projects. Journal of Molecular Biology, 1998, 278(3):599-608. |
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