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BASKcro新蟲 (初入文壇)
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[交流]
動物實驗日常操作系列：乳鼠心肌細胞分離
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實驗步驟： 1.乳鼠心肌細胞比成年心肌細胞容易培養(yǎng)，而且對缺血缺氧的耐受性好。 2.抓住小鼠后頸肩胛骨處，使胸腔向前。 3.用無名指和小指固定小鼠后肢。 4.將小鼠放入75%酒精中消毒。下面放一個紗布，吸取掉落酒精。 5.從小鼠左肋緣鎖骨中線處入剪刀，剪至鎖骨中線，注意剪刀上翹，如果心臟未暴露，可以自剪線的中點剪向胸骨。 6.剪取心尖部心肌，放在DMEM中。 7.用小鑷子輕輕擠壓心尖部，注意不要用力過度，避免鑷子碰撞。 8.換液，清洗二次。 9.在培養(yǎng)皿中將組織剪碎。 10.將心臟剪成1mm3大小的碎片，再將心臟碎片轉移至離心管中，加配好的胰酶和膠原酶，37°℃消化5 min至8分鐘，自然沉淀，棄上清，再加入胰酶和膠原酶，重復操作，吸取上清，反復操作6至8次，二次完成時加入血清，終止胰酶對細胞的損害。 11.操作完成后用濾器除去其中的纖維和膠原等。 12.離心換液，除去膠原酶，(膠原酶是外來物質，對細胞有損傷)將培養(yǎng)瓶放在37°C孵箱中1~2個小時，使成纖維細胞貼壁，而心肌細胞貼壁多需要6~8小時，分離作用。 13原理:心肌細胞本來就是不容易貼壁的細胞，在除去心肌細胞中混雜的成纖維細胞和內皮細胞就是利用成纖維細胞和內皮細胞貼壁快而心肌細胞貼壁慢的原理進行換皿法來純化心肌細胞的。換皿后最好48小時內對你所培養(yǎng)的心肌細胞不進行任何處理，包括觀察，這樣應該沒有問題了。如果還是不能夠貼壁的話，你可以考慮一下用塑料瓶，或者對培養(yǎng)用的玻璃瓶進行如下處理：在培養(yǎng)前進行鼠尾膠原包被或者硝酸蝕刻或者纖粘連蛋白包被，這方面可以參考文獻。 14.吸取培養(yǎng)液中的心肌細胞，將成纖維細胞保存待用，心肌細胞中加入5—溴尿喀啶（終止RNA的合成)，終止其中的成纖維細胞的分裂，并做計數(shù)。 將心肌細胞培養(yǎng)十二小時，一定不要動,放在孵箱的最里面 15.將心肌細胞凍存、傳代。 |
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