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BASKcro新蟲 (初入文壇)
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動(dòng)物實(shí)驗(yàn)日常操作系列：乳鼠心肌細(xì)胞分離
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實(shí)驗(yàn)步驟： 1.乳鼠心肌細(xì)胞比成年心肌細(xì)胞容易培養(yǎng)，而且對(duì)缺血缺氧的耐受性好。 2.抓住小鼠后頸肩胛骨處，使胸腔向前。 3.用無名指和小指固定小鼠后肢。 4.將小鼠放入75%酒精中消毒。下面放一個(gè)紗布，吸取掉落酒精。 5.從小鼠左肋緣鎖骨中線處入剪刀，剪至鎖骨中線，注意剪刀上翹，如果心臟未暴露，可以自剪線的中點(diǎn)剪向胸骨。 6.剪取心尖部心肌，放在DMEM中。 7.用小鑷子輕輕擠壓心尖部，注意不要用力過度，避免鑷子碰撞。 8.換液，清洗二次。 9.在培養(yǎng)皿中將組織剪碎。 10.將心臟剪成1mm3大小的碎片，再將心臟碎片轉(zhuǎn)移至離心管中，加配好的胰酶和膠原酶，37°℃消化5 min至8分鐘，自然沉淀，棄上清，再加入胰酶和膠原酶，重復(fù)操作，吸取上清，反復(fù)操作6至8次，二次完成時(shí)加入血清，終止胰酶對(duì)細(xì)胞的損害。 11.操作完成后用濾器除去其中的纖維和膠原等。 12.離心換液，除去膠原酶，(膠原酶是外來物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有損傷)將培養(yǎng)瓶放在37°C孵箱中1~2個(gè)小時(shí)，使成纖維細(xì)胞貼壁，而心肌細(xì)胞貼壁多需要6~8小時(shí)，分離作用。 13原理:心肌細(xì)胞本來就是不容易貼壁的細(xì)胞，在除去心肌細(xì)胞中混雜的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞就是利用成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞貼壁快而心肌細(xì)胞貼壁慢的原理進(jìn)行換皿法來純化心肌細(xì)胞的。換皿后最好48小時(shí)內(nèi)對(duì)你所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞不進(jìn)行任何處理，包括觀察，這樣應(yīng)該沒有問題了。如果還是不能夠貼壁的話，你可以考慮一下用塑料瓶，或者對(duì)培養(yǎng)用的玻璃瓶進(jìn)行如下處理：在培養(yǎng)前進(jìn)行鼠尾膠原包被或者硝酸蝕刻或者纖粘連蛋白包被，這方面可以參考文獻(xiàn)。 14.吸取培養(yǎng)液中的心肌細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞保存待用，心肌細(xì)胞中加入5—溴尿喀啶（終止RNA的合成)，終止其中的成纖維細(xì)胞的分裂，并做計(jì)數(shù)。 將心肌細(xì)胞培養(yǎng)十二小時(shí)，一定不要?jiǎng)?放在孵箱的最里面 15.將心肌細(xì)胞凍存、傳代。 |
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