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今天分享一篇發(fā)表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，名為《Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry》[1]（用納米流式檢測(cè)技術(shù)分析單顆粒水平的細(xì)胞外囊泡DNA）。
細(xì)胞外囊泡(EVs)是幾乎所有細(xì)胞類型都分泌的納米級(jí)膜囊泡，通過(guò)將蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間通信。最近的研究表明，EV中存在基因組DNA、線粒體DNA甚至病毒DNA。通過(guò)DNA的包裝和水平轉(zhuǎn)移，EV在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。最近，基于EV-DNA的液體活檢診斷癌癥的技術(shù)已被開發(fā)。雖然EV-DNA的生物學(xué)意義已被認(rèn)識(shí)到，但對(duì)EV-DNA的研究較少，許多基本特征仍存在爭(zhēng)議，如DNA是否與所有或某些EV亞群相關(guān)？EV-DNA是否位于EV的腔內(nèi)和/或表面？DNA含量與EV大小之間有什么關(guān)系？EV-DNA是單鏈DNA(ssDNA)還是雙鏈DNA(dsDNA)？
EV-DNA研究通常通過(guò)從EV分離物中提取DNA，然后進(jìn)行豐度、片段長(zhǎng)度和序列評(píng)估。通過(guò)將DNase酶解與片段分析系統(tǒng)相結(jié)合，研究了DNA的相對(duì)豐度和定位(在腔內(nèi)或與EV表面相關(guān))。為了明確EV亞群間EV-DNA的異質(zhì)性，我們對(duì)密度梯度離心或非對(duì)稱流場(chǎng)流分離的EV進(jìn)行了DNA分析。有研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用自底而上的碘二醇密度梯度，從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出的高密度和低密度小EV(sEVs)都含有DNA，而高密度sEVs比低密度sEVs攜帶更多的DNA。然而，使用類似的方法，有人發(fā)現(xiàn)EV分離物中的DNA與非囊泡性實(shí)體相關(guān)，而不是與EV相關(guān)。盡管批量分析法可以識(shí)別不同EV亞群中的DNA，但由于EV-DNA不能與游離DNA區(qū)分，包括與EV共分離的非囊泡狀顆粒相關(guān)的裸DNA。由于EV在大小和內(nèi)容物含量上差異很大，迫切需要單顆粒分析技術(shù)來(lái)解讀EV-DNA的巨大內(nèi)在異質(zhì)性，并將EV-DNA與游離DNA或其他污染物區(qū)分開來(lái)。然而，EV的納米級(jí)顆粒尺寸(大部分小于100nm）以及極低的內(nèi)容物含量是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。
在過(guò)去的十年里，我們的實(shí)驗(yàn)室一直致力于開發(fā)一種高靈敏度的納米流式檢測(cè)儀(nFCM)。實(shí)現(xiàn)了單個(gè)EV、病毒、二氧化硅納米顆粒和金納米顆粒的光散射檢測(cè)，最低粒徑分別為40nm、27nm、24nm和7nm。在熒光(FL)檢測(cè)中，檢測(cè)單個(gè)R-藻紅蛋白分子的信噪比為17，對(duì)有機(jī)染料的檢測(cè)限為3個(gè)AlexaFluor532分子。在本研究中，我們?cè)噲D通過(guò)結(jié)合酶解和nFCM，在單囊泡水平上分析外部和內(nèi)部的EV-DNA。研究了DNA+EV的百分比、DNA含量分布與EV大小的關(guān)系、ssDNA與dsDNA的區(qū)分、EV-DNA與組蛋白的關(guān)聯(lián)以及抗癌藥物治療后DNA含量的變化。
研究結(jié)果：
一、EV的分離和特征分析
以培養(yǎng)的HCT-15細(xì)胞上清液作為模型系統(tǒng)，通過(guò)10萬(wàn)×g超離心從CCCM中分離EV(圖1(a))。分別采用TEM和Western blot檢測(cè)EV的形態(tài)和EV制備過(guò)程中蛋白的存在。圖1(b，c)顯示了EV的良好恢復(fù)率。為了定量EV的純度，實(shí)驗(yàn)室建造的nFCM可以檢測(cè)小至40nm的EV的側(cè)向散射光，對(duì)比TritonX-100處理前后1 min收集的顆粒數(shù) 。圖1(d)顯示了一個(gè)典型的用TritonX-100處理前后的側(cè)向散射(SSC)爆發(fā)面積分布直方圖。從每個(gè)EV樣品中扣除在相同設(shè)置下測(cè)量的PBS顆粒數(shù)，得到EV分離物的純度為86%。為了檢測(cè)EV的粒徑，使用nFCM在相同的儀器設(shè)置下對(duì)47、57、59、74、95和123nm的單分散混合硅納米顆粒(SiNPs)進(jìn)行分析。SSC分布直方圖如圖S1(a)所示�？紤]到在488nm激發(fā)下，SiNPs（1.463）和EVs（1.400）的折射率差，根據(jù)Mie理論對(duì)SiNP標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)尺寸，計(jì)算了SiNP散射的光與相同粒徑的EV的強(qiáng)度比。將這些比值作為校正因子，從SiNPs數(shù)據(jù)中推導(dǎo)出散射光強(qiáng)與粒徑之間的校準(zhǔn)曲線。圖1(e)所示的EV大小分布直方圖顯示，從HCT-15細(xì)胞CCCM中分離的EV主要在40-200nm范圍內(nèi)。峰值位置和中位數(shù)分別為50和63.3nm。這些值與我們之前報(bào)道的使用超離心法從HCT-15細(xì)胞的CCCM中分離出的EV的50和64.5nm的值一致。
二、從細(xì)胞培養(yǎng)基中通過(guò)超離心制備的EV樣品中存在大量游離DNA
如圖2(a)所示，分離的EV用膜透性核酸染料SYTO 16標(biāo)記，并在nFCM上進(jìn)行分析。同時(shí)檢測(cè)到單個(gè)EV發(fā)出的SSC和綠色FL信號(hào)。通過(guò)在1-2個(gè)min中分析數(shù)千個(gè)EVs，可以快速獲得核酸綠色FL強(qiáng)度與SSC強(qiáng)度的雙變量點(diǎn)圖。為了對(duì)EV-DNA有更高的靈敏度和選擇性，篩選了6種核酸染色，包括SYTO 9、SYTO 13、SYTO 16、PicoGreen、SYBR GreenI和SYTO 82。這些染料與DNA或RNA結(jié)合的發(fā)射光譜數(shù)據(jù)表明SYTO 16與DNA的結(jié)合選擇性最高，并具有良好的FL信號(hào)強(qiáng)度。
為了檢測(cè)nFCM對(duì)DNA的靈敏度，對(duì)含有400、2000和5000堿基對(duì)(bp)的DNA片段用SYTO 16染色，并在單個(gè)DNA片段水平上進(jìn)行分析。圖2(b)(i)顯示了一個(gè)具有代表性的FL信號(hào)，它顯示了峰值高度聚集在三個(gè)不同的振幅水平附近，這與三個(gè)不同大小的DNA片段相對(duì)應(yīng)。圖2(b)(ii)所顯示的FL突發(fā)面積分布直方圖顯示，長(zhǎng)度為400bp的單個(gè)DNA片段可以很好地分辨出來(lái)，得到片段長(zhǎng)度與FL強(qiáng)度之間的線性關(guān)系(r2=0.999)。根據(jù)背景標(biāo)準(zhǔn)差的三倍和3個(gè)bins的峰值寬度(0.3 ms)計(jì)算出檢測(cè)限為185bp。這些數(shù)據(jù)不僅證實(shí)了插入染料分子可對(duì)DNA進(jìn)行化學(xué)計(jì)量，而且表明nFCM對(duì)單個(gè)EV中DNA含量的定量分析具有很高的靈敏度。需要注意的是，單個(gè)EV的DNA是由不同長(zhǎng)度的DNA片段組成的，每個(gè)長(zhǎng)度的DNA片段可能有不同的拷貝數(shù)，只要單個(gè)EV的總DNA片段長(zhǎng)度大于～200bp，nFCM可以將EV-DNA與背景區(qū)分開來(lái)。
然后，我們根據(jù)MIFlowCyt-EV指南，通過(guò)nFCM分析SYTO 16染色的EV。圖2(c)顯示了染色EV樣本的代表性SSC和FL信號(hào)。與同時(shí)有FL和SSC信號(hào)的事件相比，有更多的事件（其中幾個(gè)用星號(hào)*表示）只顯示FL信號(hào)。這些事件可以是裸DNA或與非囊泡性實(shí)體相關(guān)的DNA，如與EV共同分離的無(wú)法被nFCM檢測(cè)到SSC信號(hào)的蛋白質(zhì)。這些DNA隨后被表示為游離DNA。同時(shí)，偶爾會(huì)觀察到只有SSC信號(hào)而沒(méi)有同時(shí)出現(xiàn)的FL信號(hào)（用?表示）的事件，如圖2(c).所示這些事件可以歸因于DNA陰性(DNA-)EV或緩沖液或鞘液中的雜質(zhì)顆粒。用通過(guò)220nm膜過(guò)濾的PBS作為樣品，測(cè)量雜質(zhì)顆粒的事件率為217±7/min。圖2(c)(iii)顯示了僅有FL和同時(shí)有FL和SSC信號(hào)的分布直方圖。這兩個(gè)群的FL強(qiáng)度中位數(shù)分別為1280和2707。在3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，僅檢測(cè)到FL信號(hào)的事件占所有可檢測(cè)到FL的事件為61.6±2.5%，甚至高于同時(shí)檢測(cè)到FL和SSC信號(hào)的事件（38.8±2.5%）。另外，對(duì)100,000×g超離心前后的lambdaDNA片段(48.5kbp)進(jìn)行的nFCM分析表明，在超離心后，裸DNA片段可以很好地保留在溶液相中。
三、在EV-DNA定位和EV大小方面存在兩個(gè)EV群體
圖3(a)顯示了一個(gè)EV分離物的代表性SSC和FL信號(hào)，以及SYTO 16 FL強(qiáng)度與SSC的雙變量點(diǎn)圖。與圖2(c)(i)和(ii)相似，可以識(shí)別出三個(gè)不同的群體，特別是在圖3(a)(iii)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的點(diǎn)圖中，僅有FL、僅有SSC和同時(shí)有SSC和FL的事件分別代表游離DNA、碎片/DNA-EV和DNA+EV。對(duì)于DNA+EV，單個(gè)EV的DNA含量大約有三個(gè)數(shù)量級(jí)的變化。此外，DNA+EV可以沿對(duì)角線分為兩個(gè)部分，即SSC低/SYTO 16高和SSC高/SYTO 16低。根據(jù)MIFlowCyt-EV指南，洗滌劑對(duì)照可用于確定檢測(cè)到的事件是EV還是非EV實(shí)體。在使用1% tritonX-100裂解EV后，DNA+粒子(可檢測(cè)到SSC信號(hào))事件率從2907±184下降到286±138，DNA-粒子事件率從2231±154下降到307±134。值得注意的是，這種TritonX-100處理基本上不會(huì)使無(wú)囊泡的DNA變性或分解DNA。這些結(jié)果表明，nFCM檢測(cè)到的90%的DNA+事件是EV，而不是與DNA相關(guān)的大型非囊泡實(shí)體。同時(shí)，86%的DNA-事件是DNA-EV，而不是雜質(zhì)粒子。
為了確認(rèn)附著在EV外膜上的DNA的存在，在SYTO 16染色和nFCM分析之前，我們用DNase I處理EV，這是一種內(nèi)切酶，通過(guò)水解磷酸二酯鍵非特異性地酶切ssDNA和dsDNA。通過(guò)優(yōu)化，使用0.2-U/μl無(wú)RNAse的DNaseI處理EV。具有代表性的SSC和F信號(hào)(圖3(b)(i)和(ii))表明，在DNaseI處理后，與圖3(a)(i)和(ii)相比，最初豐富的僅有FL事件消失了。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的雙變量點(diǎn)圖SYTO 16 FL強(qiáng)度與SSC相比(圖3(b)(iii))表明，在DNase I處理后，游離DNA群體和SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亞群幾乎完全消失。為了驗(yàn)證DNase I處理后EV結(jié)構(gòu)的維持，我們對(duì)三種經(jīng)典的跨膜蛋白CD9、CD63和CD81進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記。DNase I消化前后的SSC和FL信號(hào)均無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表明，本研究中使用的DNaseI處理方案促進(jìn)了EV外部DNA的有效消化，同時(shí)保持了EV的結(jié)構(gòu)和完整性�？紤]到只有EV內(nèi)的DNA才能被保護(hù)避免被酶消化，SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亞群可以被鑒定為DNA主要附著在外表面的EV。為了排除在超離心過(guò)程中DNA和EV被迫聚集的情況，我們直接用SYTO 16對(duì)CCCM進(jìn)行染色，并使用nFCM進(jìn)行分析。CCCM的DNA+顆粒百分比為30.0%。用DNase I降解外DNA后，DNA+群體的比例下降至6.5%。同時(shí)，使用1%的TritonX-100在CCCM中溶解EV，可檢測(cè)到SSC信號(hào)的DNA+粒子的事件率從2554下降到240。這些結(jié)果表明，在CCCM中檢測(cè)到的DNA+顆粒主要是EV，在超離心過(guò)程中，DNA自然分布在EV表面，而不是被迫聚集在EV表面。
為了便于解釋EV-DNA與EV大小的相關(guān)性，我們根據(jù)上述程序(圖1將SSC強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為EV大小)，忽略游離DNA。圖3(c)(i)和(ii)所示的SYTO 16FL強(qiáng)度與EV大小的雙變量點(diǎn)圖表明，在所有可檢測(cè)到SSC信號(hào)的事件中，經(jīng)DNase I處理后，DNA+EV的百分比從60.6%下降到26.0%。DNase I處理前后DNA+EV粒徑分布和SYTO 16 FL強(qiáng)度的分布直方圖見圖3(c)(iii)和(iv)。顯然，對(duì)于從HCT-15 CCCM超離心獲取的EV，表面有DNA附著的EV尺寸相對(duì)較�。�40-100nm），且包含更多的DNA含量，而內(nèi)部封裝DNA的EV相對(duì)較大，大約從80到200nm，包含更少的DNA含量。外DNA+EV和內(nèi)部DNA+EV的FL強(qiáng)度中位值分別為2350和750，表明EV表面的DNA多于腔內(nèi)。還以含有400、2000和5000bpDNA片段的混合物作為外標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)了單個(gè)EV的總DNA長(zhǎng)度，并確定了200~550,000bp的大變異。
雖然SYTO 16對(duì)DNA染色的偏好更大，但它也輕微地標(biāo)記了RNA。為了實(shí)現(xiàn)DNA的高度選擇性標(biāo)記，通過(guò)代謝生物合成途徑將乙基修飾的dUTP(EdU)納入新合成的DNA中，然后通過(guò)鏈接化學(xué)與azide-AF488進(jìn)行化學(xué)選擇性偶聯(lián)(圖3d(i))。使用常規(guī)流式進(jìn)行的單細(xì)胞分析顯示，EdU成功融入細(xì)胞，91.7%的細(xì)胞EdU陽(yáng)性。然而，由于單個(gè)EV的DNA含量較小，只有11.3%的EV為EdU陽(yáng)性(圖3(d)(iii))。然而，在DNase I消化后，該群比例下降到3.0%，顯示顯著下降的DNA+EV相對(duì)較小，相對(duì)較大的EV幾乎沒(méi)有變化。EdU摻入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了用SYTO 16染色觀察到，內(nèi)部DNA主要被尺寸相對(duì)較大的EV封裝在腔內(nèi)，而外部DNA主要與相對(duì)較小的EV有關(guān)。
為了測(cè)量EV-DNA的片段長(zhǎng)度，EV被分為兩個(gè)等分：一個(gè)用DNase I處理，另一個(gè)在DNA分離前保持不處理。對(duì)未經(jīng)DNase I處理的EV中提取的DNA進(jìn)行芯片毛細(xì)管電泳顯示，總DNA范圍在1000~50000bp之間(圖3(e)(i))。在這一階段，不添加DNase I，DNA含量就包括表面附著和囊內(nèi)DNA以及與EV共分離的游離DNA。在使用DNase I消化囊外DNA(外部EV-DNA和游離DNA)后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部EV-DNA在200-1200bp的范圍內(nèi)。由于內(nèi)部EV-DNA的含量極低，內(nèi)部DNA通過(guò)快速真空凍干法濃縮了10倍，并與未濃縮的樣品平行分析。值得注意的是，我們?cè)噲D通過(guò)尺寸排除色譜(SEC)或密度梯度超離心法獲得無(wú)游離DNA的EV，以進(jìn)一步純化超離心法獲得的EV。nFCM的單粒子分析表明，SEC很難從EV中分離出游離DNA。雖然密度梯度超離心法可以有效地從EV中分離出游離的DNA，但由于嚴(yán)苛的分離過(guò)程，粘附在EV表面的EV-DNA大部分與表面分離。
四、內(nèi)外EV-DNA ssDNA和dsDNA的原位分析
為了確定外部EV-DNA是ssDNA還是dsDNA，用DNase I、dsDNase(針對(duì)dsDNA)或S1核酸酶(針對(duì)ssDNA) 處理或不處理的EV，用SYTO 16進(jìn)行標(biāo)記，并在nFCM上進(jìn)行分析。以純化的lambdaDNA和ssDNA寡核苷酸為底物，驗(yàn)證了dsDNase和S1核酸酶的功能和特異性。圖4(a)顯示了在可檢測(cè)到SSC信號(hào)的事件中，未處理或使用不同DNA酶處理的EV的SYTO 16 FL與粒徑的雙變量點(diǎn)圖。經(jīng)DNaseI消化后，DNA+EV的比例從未處理的59.9%顯著下降到26.4%，與圖3(a，b)的結(jié)果一致。用dsDNase預(yù)處理也導(dǎo)致DNA+EV比值顯著降低到29.4%，與DNaseI處理相似。與此同時(shí)，經(jīng)S1核酸酶處理的EV（62.1%）與未處理的EV樣品（59.9%）相比，沒(méi)有顯著變化。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4(b)所示，說(shuō)明外部EV-DNA主要是雙鏈的。
圖4(c)顯示了內(nèi)部EV-DNA的ssDNA和dsDNA之間的原位分化示意圖。首先用DNaseI消化外部EV-DNA，然后將EV固定透膜，并不使用或使用不同的DNase進(jìn)行處理。圖4(d)(i)顯示，DNaseI處理后固定和滲透后，DNA+EV的百分比為27.0%。圖4(d)(i)和4(a)(ii)中DNA+EV和EV分布的可比性群體表明，EV膜固定和滲透過(guò)程對(duì)EV結(jié)構(gòu)完整性的影響可以忽略不計(jì)。當(dāng)用DNaseI消化內(nèi)部EV-DNA時(shí)，DNA+EV的群體比例顯著下降到7.2%(圖4(d)(ii))。當(dāng)用dsDNase處理內(nèi)部EV-DNA時(shí)，觀察到DNA+EV的事件顯著下降（至5.7%）(iii)。同時(shí)，S1核酸酶處理幾乎沒(méi)有導(dǎo)致DNA+EV群體的減少(iv)。每種樣本類型的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)如圖4(e)所示。這些結(jié)果表明，dsDNA是內(nèi)部EV-DNA的主要形式。
五、抑制外泌體分泌減少了DNA主要附著在外表面的相對(duì)較小的EV的數(shù)量
圖3和圖4顯示，似乎存在兩群EV，相對(duì)較小的EV（40-100nm）主要攜帶長(zhǎng)的和更多的DNA片段附著在外表面，而相對(duì)較大的EV（80-200nm）通常有短和更少的DNA片段(0.2-2kbp)封裝在內(nèi)部。為了研究外部和內(nèi)部EV-DNA是否來(lái)自不同的生物發(fā)生途徑，我們使用中性鞘磷脂酶的特異性抑制劑GW4869抑制外泌體分泌，處理HCT-15細(xì)胞24小時(shí)。圖5(a)顯示，隨著GW4869濃度的增加，從HCT-15細(xì)胞CCCM中收獲的EV數(shù)量減少，直到達(dá)到10-μM GW4869時(shí)為原始值的50%。圖5(b)顯示，10-μM GW4869處理后，DNA+EV的比例從DMSO對(duì)照的48.4%下降到19.4%，DNA含量降低的EV主要是小于100nm的EV。這些結(jié)果與外泌體主要是小EV的觀點(diǎn)相一致。然后對(duì)有無(wú)GW4869處理的EV進(jìn)行DNase I處理。將圖5(b)(i)和5(c)(i)中所示的SYTO 16 FL與EV大小的雙變量點(diǎn)圖進(jìn)行比較，顯示了與圖3(a，b)中觀察到的相似的現(xiàn)象。對(duì)于大多數(shù)小EV，DNA主要附著在外表面，經(jīng)DNaseI處理后降解；然而，對(duì)于大多數(shù)大EV，DNA主要封閉在EV內(nèi)，并能很好地免受DNaseI消化的影響。當(dāng)比較圖5(b)(ii)和5(c)(ii)時(shí)，從GW4869處理的細(xì)胞中分離的DNaseI消化前后的DNA+EV群體沒(méi)有顯著差異(19.4% vs 17.7%)。這些結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞在GW4869中培養(yǎng)時(shí)，外泌體的分泌受到大量抑制。由于其余的EV相對(duì)較大(80-200nm)，DNA主要被封閉在腔內(nèi)，DNaseI消化對(duì)分離的EV的影響最小。這一群體可以歸因于從質(zhì)膜直接出芽形成的微囊泡。每個(gè)處理的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5(d)所示，當(dāng)10-μM GW4869抑制外泌體分泌途徑時(shí)，DNA附著或DNaseI處理后消失的EV種群從最初的38.4%（51.8%–13.4%）顯著下降到5.7%（22.0%–16.3%）。
六、組蛋白(H3)在EV中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，EV-DNA與組蛋白無(wú)關(guān)
以上數(shù)據(jù)表明，相對(duì)較小的EV(＜100nm)主要包含附著在表面的DNA。為了研究這種粘附是否通過(guò)膜蛋白的粘附，分離的EV用蛋白酶K處理，用SYTO 16染色，并在nFCM上進(jìn)行分析。圖6(a)顯示，DNA+EV的比例從未處理的60.4%下降到37.4%，說(shuō)明在蛋白酶K處理后，23.0%的EV的DNA從EV表面脫落。將這種分離率與DNaseI處理的33.5%(61.4%–27.9%，圖4(b))降解率進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EV-DNA出現(xiàn)在外表面是通過(guò)附著在外膜蛋白上的。由于在EV中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了DNA結(jié)合組蛋白，本研究檢測(cè)了EV-DNA和組蛋白之間是否存在任何關(guān)系。Western blot分析證實(shí)了EV制劑中存在組蛋白H3(圖6(b)(i))，免疫金透射電鏡分析顯示，組蛋白H3主要與EV的小的非囊泡狀顆粒有關(guān)，而不是EV的外表面(圖6(b)(ii))。為了確定組蛋白是否存在于EV表面或內(nèi)部，免疫表型通過(guò)將熒光標(biāo)記抗體與無(wú)或有膜通透的EV孵育。4%PFA固定后，用含0.2%Tween20(v/v)的PBS滲透EV膜，用β-actin，一種主要在EV腔內(nèi)恢復(fù)的細(xì)胞骨架蛋白，而不是EV外膜，作為陽(yáng)性對(duì)照。圖6(c)(ii)和6(d)(ii)顯示，EV膜通透后，β-actin+EV的種群比例從12.0%增加到52.9%，表明EV膜通透和腔內(nèi)蛋白標(biāo)記效率良好。另一方面，對(duì)于H3+EV有無(wú)進(jìn)行EV膜透的百分比相當(dāng)(2.0%vs.1.8%)(圖6(c)(iii)和6(d)(iii))，接近其相應(yīng)的同型對(duì)照水平(圖6(c)(i)和6(d)(i))。此外，對(duì)HCT-15細(xì)胞的常規(guī)FCM分析顯示，細(xì)胞中存在組蛋白H3，并且所使用的單克隆抗體有利于組蛋白H3的標(biāo)記。因此，這些結(jié)果表明，在EV中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組蛋白；然而，它們和與EV共分離的非囊泡狀顆粒有關(guān)。因此，EV-DNA與組蛋白無(wú)關(guān)。
七、抗癌藥物誘導(dǎo)DNA+EV數(shù)量和個(gè)體EV中DNA含量的增加
EV通過(guò)從細(xì)胞中提取有害的細(xì)胞質(zhì)DNA，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，癌細(xì)胞分泌的EV比正常細(xì)胞釋放的EV攜帶更多的DNA片段。本研究對(duì)兩對(duì)正常和腫瘤細(xì)胞系CCD-18Co和人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-15、人鼻咽癌上皮細(xì)胞系NP69和鼻咽癌細(xì)胞系C666-1進(jìn)行EV-DNA比較。通過(guò)比較正常細(xì)胞和癌細(xì)胞分泌的DNA+EVs的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分泌的DNA+EVs的比例顯著較高(CCD-18Co，35.1±8.4%；HCT-15,57.3%±3.0%；NP69,34.4±5.6%和C666-1,82.7±6.4%)(圖7(a))。經(jīng)DNaseI處理消化外部EV-DNA后，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的DNA+EV的百分比相當(dāng)(CCD-18Co，20.1±4.6%；HCT-15,25.2%±1.5%；NP69,20.5±2.2%和C666-1,24.5±6.0%)(圖7(a))。這些數(shù)據(jù)表明，由于其固有的基因組不穩(wěn)定性，癌細(xì)胞比正常細(xì)胞分泌更多的DNA+EV，而這種差異主要是由于外部DNA+EV比例的差異。
越來(lái)越多的證據(jù)表明，抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)相當(dāng)大的染色體不穩(wěn)定和細(xì)胞衰老。因此，癌細(xì)胞通過(guò)釋放大量攜帶更多DNA含量的EV來(lái)維持細(xì)胞，從而改變其EV分泌譜穩(wěn)態(tài)。為了檢測(cè)單EV水平上的EV-DNA變化，我們用基因毒性藥物依托泊苷(拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑)(100μM)、SN-38(拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑)(10μM)或拓?fù)涮婵?拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑)(20μM)處理HCT-15細(xì)胞。在任何一種藥物治療后，含有DNA的EV數(shù)量顯著從對(duì)照組的45.8%(0.02%DMSO)顯著增加到依托泊苷、SN-38和拓?fù)涮婵档?5.1%、71.0%和77.2%(圖7(b))。此外，與個(gè)體EV中DNA含量對(duì)應(yīng)的中位FL強(qiáng)度也從對(duì)照組的620顯著增加到依托泊苷、SN-38和拓?fù)涮婵档?464、1812和1496。這些結(jié)果表明，抗癌藥物治療后，單個(gè)EV的DNA數(shù)量和DNA+EV數(shù)量均增加。為了研究藥物治療后內(nèi)部EV-DNA的變化，在SYTO 16染色前，我們使用DNaseI消化外部EV-DNA。圖7(c)顯示，在兩種藥物治療后，內(nèi)部DNA+EV的數(shù)量顯著增加(0.02%DMSO，24.0%；依托泊苷為36.7%；SN-38為39.6%，拓?fù)涮婵禐?0.5%)。同時(shí)，中位FL強(qiáng)度也顯著增加（0.02%DMSO，440；依托泊苷，841；SN-38,980和topotecan，785）。每個(gè)處理的三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)如圖7(d)所示。0.02%DMSO、100μM依托泊苷、10μM SN-38和20μM拓?fù)涮婵档腄NA+EV的百分比分別為42.0±3.3%、79.2%±2.3%、75.3±3.6%和75.9±4.6%。經(jīng)DNaseI處理后，0.02%DMSO、100-μM依托泊苷、10-μM SN-38和20-μM拓?fù)涮婵档膬?nèi)DNA+EV的百分比分別為22.3±2.4%、36.4%±5.5%、38.9±5.0%和41.9±4.1%。
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參考文獻(xiàn)：
[1]Liu Haisheng,Tian Ye,Xue Chengfeng,et al.Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry.Journal of extracellular vesicles.2022;11 (4)：e12206.doi:10.1002/jev2.12206
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