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外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（二十）
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今天分享一篇發(fā)表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，名為《Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry》[1]（用納米流式檢測技術分析單顆粒水平的細胞外囊泡DNA）。

細胞外囊泡(EVs)是幾乎所有細胞類型都分泌的納米級膜囊泡，通過將蛋白質、核酸和脂質從供體細胞轉移到受體細胞來介導細胞間通信。最近的研究表明，EV中存在基因組DNA、線粒體DNA甚至病毒DNA。通過DNA的包裝和水平轉移，EV在維持細胞穩(wěn)態(tài)、調節(jié)免疫反應和調節(jié)腫瘤進展中發(fā)揮著關鍵作用。最近，基于EV-DNA的液體活檢診斷癌癥的技術已被開發(fā)。雖然EV-DNA的生物學意義已被認識到，但對EV-DNA的研究較少，許多基本特征仍存在爭議，如DNA是否與所有或某些EV亞群相關？EV-DNA是否位于EV的腔內和/或表面？DNA含量與EV大小之間有什么關系？EV-DNA是單鏈DNA(ssDNA)還是雙鏈DNA(dsDNA)？

EV-DNA研究通常通過從EV分離物中提取DNA，然后進行豐度、片段長度和序列評估。通過將DNase酶解與片段分析系統相結合，研究了DNA的相對豐度和定位(在腔內或與EV表面相關)。為了明確EV亞群間EV-DNA的異質性，我們對密度梯度離心或非對稱流場流分離的EV進行了DNA分析。有研究者發(fā)現，通過使用自底而上的碘二醇密度梯度，從細胞培養(yǎng)基中分離出的高密度和低密度小EV(sEVs)都含有DNA，而高密度sEVs比低密度sEVs攜帶更多的DNA。然而，使用類似的方法，有人發(fā)現EV分離物中的DNA與非囊泡性實體相關，而不是與EV相關。盡管批量分析法可以識別不同EV亞群中的DNA，但由于EV-DNA不能與游離DNA區(qū)分，包括與EV共分離的非囊泡狀顆粒相關的裸DNA。由于EV在大小和內容物含量上差異很大，迫切需要單顆粒分析技術來解讀EV-DNA的巨大內在異質性，并將EV-DNA與游離DNA或其他污染物區(qū)分開來。然而，EV的納米級顆粒尺寸(大部分小于100nm）以及極低的內容物含量是一個巨大挑戰(zhàn)。

在過去的十年里，我們的實驗室一直致力于開發(fā)一種高靈敏度的納米流式檢測儀(nFCM)。實現了單個EV、病毒、二氧化硅納米顆粒和金納米顆粒的光散射檢測，最低粒徑分別為40nm、27nm、24nm和7nm。在熒光(FL)檢測中，檢測單個R-藻紅蛋白分子的信噪比為17，對有機染料的檢測限為3個AlexaFluor532分子。在本研究中，我們試圖通過結合酶解和nFCM，在單囊泡水平上分析外部和內部的EV-DNA。研究了DNA+EV的百分比、DNA含量分布與EV大小的關系、ssDNA與dsDNA的區(qū)分、EV-DNA與組蛋白的關聯以及抗癌藥物治療后DNA含量的變化。

研究結果：

一、EV的分離和特征分析

以培養(yǎng)的HCT-15細胞上清液作為模型系統，通過10萬×g超離心從CCCM中分離EV(圖1(a))。分別采用TEM和Western blot檢測EV的形態(tài)和EV制備過程中蛋白的存在。圖1(b，c)顯示了EV的良好恢復率。為了定量EV的純度，實驗室建造的nFCM可以檢測小至40nm的EV的側向散射光，對比TritonX-100處理前后1 min收集的顆粒數 。圖1(d)顯示了一個典型的用TritonX-100處理前后的側向散射(SSC)爆發(fā)面積分布直方圖。從每個EV樣品中扣除在相同設置下測量的PBS顆粒數，得到EV分離物的純度為86%。為了檢測EV的粒徑，使用nFCM在相同的儀器設置下對47、57、59、74、95和123nm的單分散混合硅納米顆粒(SiNPs)進行分析。SSC分布直方圖如圖S1(a)所示�？紤]到在488nm激發(fā)下，SiNPs（1.463）和EVs（1.400）的折射率差，根據Mie理論對SiNP標準的每個尺寸，計算了SiNP散射的光與相同粒徑的EV的強度比。將這些比值作為校正因子，從SiNPs數據中推導出散射光強與粒徑之間的校準曲線。圖1(e)所示的EV大小分布直方圖顯示，從HCT-15細胞CCCM中分離的EV主要在40-200nm范圍內。峰值位置和中位數分別為50和63.3nm。這些值與我們之前報道的使用超離心法從HCT-15細胞的CCCM中分離出的EV的50和64.5nm的值一致。

二、從細胞培養(yǎng)基中通過超離心制備的EV樣品中存在大量游離DNA

如圖2(a)所示，分離的EV用膜透性核酸染料SYTO 16標記，并在nFCM上進行分析。同時檢測到單個EV發(fā)出的SSC和綠色FL信號。通過在1-2個min中分析數千個EVs，可以快速獲得核酸綠色FL強度與SSC強度的雙變量點圖。為了對EV-DNA有更高的靈敏度和選擇性，篩選了6種核酸染色，包括SYTO 9、SYTO 13、SYTO 16、PicoGreen、SYBR GreenI和SYTO 82。這些染料與DNA或RNA結合的發(fā)射光譜數據表明SYTO 16與DNA的結合選擇性最高，并具有良好的FL信號強度。

為了檢測nFCM對DNA的靈敏度，對含有400、2000和5000堿基對(bp)的DNA片段用SYTO 16染色，并在單個DNA片段水平上進行分析。圖2(b)(i)顯示了一個具有代表性的FL信號，它顯示了峰值高度聚集在三個不同的振幅水平附近，這與三個不同大小的DNA片段相對應。圖2(b)(ii)所顯示的FL突發(fā)面積分布直方圖顯示，長度為400bp的單個DNA片段可以很好地分辨出來，得到片段長度與FL強度之間的線性關系(r2=0.999)。根據背景標準差的三倍和3個bins的峰值寬度(0.3 ms)計算出檢測限為185bp。這些數據不僅證實了插入染料分子可對DNA進行化學計量，而且表明nFCM對單個EV中DNA含量的定量分析具有很高的靈敏度。需要注意的是，單個EV的DNA是由不同長度的DNA片段組成的，每個長度的DNA片段可能有不同的拷貝數，只要單個EV的總DNA片段長度大于～200bp，nFCM可以將EV-DNA與背景區(qū)分開來。

然后，我們根據MIFlowCyt-EV指南，通過nFCM分析SYTO 16染色的EV。圖2(c)顯示了染色EV樣本的代表性SSC和FL信號。與同時有FL和SSC信號的事件相比，有更多的事件（其中幾個用星號*表示）只顯示FL信號。這些事件可以是裸DNA或與非囊泡性實體相關的DNA，如與EV共同分離的無法被nFCM檢測到SSC信號的蛋白質。這些DNA隨后被表示為游離DNA。同時，偶爾會觀察到只有SSC信號而沒有同時出現的FL信號（用?表示）的事件，如圖2(c).所示這些事件可以歸因于DNA陰性(DNA-)EV或緩沖液或鞘液中的雜質顆粒。用通過220nm膜過濾的PBS作為樣品，測量雜質顆粒的事件率為217±7/min。圖2(c)(iii)顯示了僅有FL和同時有FL和SSC信號的分布直方圖。這兩個群的FL強度中位數分別為1280和2707。在3個重復實驗中，僅檢測到FL信號的事件占所有可檢測到FL的事件為61.6±2.5%，甚至高于同時檢測到FL和SSC信號的事件（38.8±2.5%）。另外，對100,000×g超離心前后的lambdaDNA片段(48.5kbp)進行的nFCM分析表明，在超離心后，裸DNA片段可以很好地保留在溶液相中。

三、在EV-DNA定位和EV大小方面存在兩個EV群體

圖3(a)顯示了一個EV分離物的代表性SSC和FL信號，以及SYTO 16 FL強度與SSC的雙變量點圖。與圖2(c)(i)和(ii)相似，可以識別出三個不同的群體，特別是在圖3(a)(iii)中具有統計學意義的點圖中，僅有FL、僅有SSC和同時有SSC和FL的事件分別代表游離DNA、碎片/DNA-EV和DNA+EV。對于DNA+EV，單個EV的DNA含量大約有三個數量級的變化。此外，DNA+EV可以沿對角線分為兩個部分，即SSC低/SYTO 16高和SSC高/SYTO 16低。根據MIFlowCyt-EV指南，洗滌劑對照可用于確定檢測到的事件是EV還是非EV實體。在使用1% tritonX-100裂解EV后，DNA+粒子(可檢測到SSC信號)事件率從2907±184下降到286±138，DNA-粒子事件率從2231±154下降到307±134。值得注意的是，這種TritonX-100處理基本上不會使無囊泡的DNA變性或分解DNA。這些結果表明，nFCM檢測到的90%的DNA+事件是EV，而不是與DNA相關的大型非囊泡實體。同時，86%的DNA-事件是DNA-EV，而不是雜質粒子。

為了確認附著在EV外膜上的DNA的存在，在SYTO 16染色和nFCM分析之前，我們用DNase I處理EV，這是一種內切酶，通過水解磷酸二酯鍵非特異性地酶切ssDNA和dsDNA。通過優(yōu)化，使用0.2-U/μl無RNAse的DNaseI處理EV。具有代表性的SSC和F信號(圖3(b)(i)和(ii))表明，在DNaseI處理后，與圖3(a)(i)和(ii)相比，最初豐富的僅有FL事件消失了。有統計學意義的雙變量點圖SYTO 16 FL強度與SSC相比(圖3(b)(iii))表明，在DNase I處理后，游離DNA群體和SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亞群幾乎完全消失。為了驗證DNase I處理后EV結構的維持，我們對三種經典的跨膜蛋白CD9、CD63和CD81進行了免疫熒光標記。DNase I消化前后的SSC和FL信號均無明顯變化。這些結果表明，本研究中使用的DNaseI處理方案促進了EV外部DNA的有效消化，同時保持了EV的結構和完整性�？紤]到只有EV內的DNA才能被保護避免被酶消化，SSC低/SYTO 16高的DNA+EV亞群可以被鑒定為DNA主要附著在外表面的EV。為了排除在超離心過程中DNA和EV被迫聚集的情況，我們直接用SYTO 16對CCCM進行染色，并使用nFCM進行分析。CCCM的DNA+顆粒百分比為30.0%。用DNase I降解外DNA后，DNA+群體的比例下降至6.5%。同時，使用1%的TritonX-100在CCCM中溶解EV，可檢測到SSC信號的DNA+粒子的事件率從2554下降到240。這些結果表明，在CCCM中檢測到的DNA+顆粒主要是EV，在超離心過程中，DNA自然分布在EV表面，而不是被迫聚集在EV表面。

為了便于解釋EV-DNA與EV大小的相關性，我們根據上述程序(圖1將SSC強度轉換為EV大小)，忽略游離DNA。圖3(c)(i)和(ii)所示的SYTO 16FL強度與EV大小的雙變量點圖表明，在所有可檢測到SSC信號的事件中，經DNase I處理后，DNA+EV的百分比從60.6%下降到26.0%。DNase I處理前后DNA+EV粒徑分布和SYTO 16 FL強度的分布直方圖見圖3(c)(iii)和(iv)。顯然，對于從HCT-15 CCCM超離心獲取的EV，表面有DNA附著的EV尺寸相對較�。�40-100nm），且包含更多的DNA含量，而內部封裝DNA的EV相對較大，大約從80到200nm，包含更少的DNA含量。外DNA+EV和內部DNA+EV的FL強度中位值分別為2350和750，表明EV表面的DNA多于腔內。還以含有400、2000和5000bpDNA片段的混合物作為外標準，估計了單個EV的總DNA長度，并確定了200~550,000bp的大變異。

雖然SYTO 16對DNA染色的偏好更大，但它也輕微地標記了RNA。為了實現DNA的高度選擇性標記，通過代謝生物合成途徑將乙基修飾的dUTP(EdU)納入新合成的DNA中，然后通過鏈接化學與azide-AF488進行化學選擇性偶聯(圖3d(i))。使用常規(guī)流式進行的單細胞分析顯示，EdU成功融入細胞，91.7%的細胞EdU陽性。然而，由于單個EV的DNA含量較小，只有11.3%的EV為EdU陽性(圖3(d)(iii))。然而，在DNase I消化后，該群比例下降到3.0%，顯示顯著下降的DNA+EV相對較小，相對較大的EV幾乎沒有變化。EdU摻入實驗證實了用SYTO 16染色觀察到，內部DNA主要被尺寸相對較大的EV封裝在腔內，而外部DNA主要與相對較小的EV有關。

為了測量EV-DNA的片段長度，EV被分為兩個等分：一個用DNase I處理，另一個在DNA分離前保持不處理。對未經DNase I處理的EV中提取的DNA進行芯片毛細管電泳顯示，總DNA范圍在1000~50000bp之間(圖3(e)(i))。在這一階段，不添加DNase I，DNA含量就包括表面附著和囊內DNA以及與EV共分離的游離DNA。在使用DNase I消化囊外DNA(外部EV-DNA和游離DNA)后，發(fā)現內部EV-DNA在200-1200bp的范圍內。由于內部EV-DNA的含量極低，內部DNA通過快速真空凍干法濃縮了10倍，并與未濃縮的樣品平行分析。值得注意的是，我們試圖通過尺寸排除色譜(SEC)或密度梯度超離心法獲得無游離DNA的EV，以進一步純化超離心法獲得的EV。nFCM的單粒子分析表明，SEC很難從EV中分離出游離DNA。雖然密度梯度超離心法可以有效地從EV中分離出游離的DNA，但由于嚴苛的分離過程，粘附在EV表面的EV-DNA大部分與表面分離。

四、內外EV-DNA ssDNA和dsDNA的原位分析

為了確定外部EV-DNA是ssDNA還是dsDNA，用DNase I、dsDNase(針對dsDNA)或S1核酸酶(針對ssDNA) 處理或不處理的EV，用SYTO 16進行標記，并在nFCM上進行分析。以純化的lambdaDNA和ssDNA寡核苷酸為底物，驗證了dsDNase和S1核酸酶的功能和特異性。圖4(a)顯示了在可檢測到SSC信號的事件中，未處理或使用不同DNA酶處理的EV的SYTO 16 FL與粒徑的雙變量點圖。經DNaseI消化后，DNA+EV的比例從未處理的59.9%顯著下降到26.4%，與圖3(a，b)的結果一致。用dsDNase預處理也導致DNA+EV比值顯著降低到29.4%，與DNaseI處理相似。與此同時，經S1核酸酶處理的EV（62.1%）與未處理的EV樣品（59.9%）相比，沒有顯著變化。三次重復實驗的結果如圖4(b)所示，說明外部EV-DNA主要是雙鏈的。

圖4(c)顯示了內部EV-DNA的ssDNA和dsDNA之間的原位分化示意圖。首先用DNaseI消化外部EV-DNA，然后將EV固定透膜，并不使用或使用不同的DNase進行處理。圖4(d)(i)顯示，DNaseI處理后固定和滲透后，DNA+EV的百分比為27.0%。圖4(d)(i)和4(a)(ii)中DNA+EV和EV分布的可比性群體表明，EV膜固定和滲透過程對EV結構完整性的影響可以忽略不計。當用DNaseI消化內部EV-DNA時，DNA+EV的群體比例顯著下降到7.2%(圖4(d)(ii))。當用dsDNase處理內部EV-DNA時，觀察到DNA+EV的事件顯著下降（至5.7%）(iii)。同時，S1核酸酶處理幾乎沒有導致DNA+EV群體的減少(iv)。每種樣本類型的三次重復實驗的數據如圖4(e)所示。這些結果表明，dsDNA是內部EV-DNA的主要形式。

五、抑制外泌體分泌減少了DNA主要附著在外表面的相對較小的EV的數量

圖3和圖4顯示，似乎存在兩群EV，相對較小的EV（40-100nm）主要攜帶長的和更多的DNA片段附著在外表面，而相對較大的EV（80-200nm）通常有短和更少的DNA片段(0.2-2kbp)封裝在內部。為了研究外部和內部EV-DNA是否來自不同的生物發(fā)生途徑，我們使用中性鞘磷脂酶的特異性抑制劑GW4869抑制外泌體分泌，處理HCT-15細胞24小時。圖5(a)顯示，隨著GW4869濃度的增加，從HCT-15細胞CCCM中收獲的EV數量減少，直到達到10-μM GW4869時為原始值的50%。圖5(b)顯示，10-μM GW4869處理后，DNA+EV的比例從DMSO對照的48.4%下降到19.4%，DNA含量降低的EV主要是小于100nm的EV。這些結果與外泌體主要是小EV的觀點相一致。然后對有無GW4869處理的EV進行DNase I處理。將圖5(b)(i)和5(c)(i)中所示的SYTO 16 FL與EV大小的雙變量點圖進行比較，顯示了與圖3(a，b)中觀察到的相似的現象。對于大多數小EV，DNA主要附著在外表面，經DNaseI處理后降解；然而，對于大多數大EV，DNA主要封閉在EV內，并能很好地免受DNaseI消化的影響。當比較圖5(b)(ii)和5(c)(ii)時，從GW4869處理的細胞中分離的DNaseI消化前后的DNA+EV群體沒有顯著差異(19.4% vs 17.7%)。這些結果表明，當細胞在GW4869中培養(yǎng)時，外泌體的分泌受到大量抑制。由于其余的EV相對較大(80-200nm)，DNA主要被封閉在腔內，DNaseI消化對分離的EV的影響最小。這一群體可以歸因于從質膜直接出芽形成的微囊泡。每個處理的三次重復實驗的結果如圖5(d)所示，當10-μM GW4869抑制外泌體分泌途徑時，DNA附著或DNaseI處理后消失的EV種群從最初的38.4%（51.8%–13.4%）顯著下降到5.7%（22.0%–16.3%）。

六、組蛋白(H3)在EV中沒有發(fā)現，EV-DNA與組蛋白無關

以上數據表明，相對較小的EV(＜100nm)主要包含附著在表面的DNA。為了研究這種粘附是否通過膜蛋白的粘附，分離的EV用蛋白酶K處理，用SYTO 16染色，并在nFCM上進行分析。圖6(a)顯示，DNA+EV的比例從未處理的60.4%下降到37.4%，說明在蛋白酶K處理后，23.0%的EV的DNA從EV表面脫落。將這種分離率與DNaseI處理的33.5%(61.4%–27.9%，圖4(b))降解率進行比較，可以發(fā)現大多數EV-DNA出現在外表面是通過附著在外膜蛋白上的。由于在EV中已經發(fā)現了DNA結合組蛋白，本研究檢測了EV-DNA和組蛋白之間是否存在任何關系。Western blot分析證實了EV制劑中存在組蛋白H3(圖6(b)(i))，免疫金透射電鏡分析顯示，組蛋白H3主要與EV的小的非囊泡狀顆粒有關，而不是EV的外表面(圖6(b)(ii))。為了確定組蛋白是否存在于EV表面或內部，免疫表型通過將熒光標記抗體與無或有膜通透的EV孵育。4%PFA固定后，用含0.2%Tween20(v/v)的PBS滲透EV膜，用β-actin，一種主要在EV腔內恢復的細胞骨架蛋白，而不是EV外膜，作為陽性對照。圖6(c)(ii)和6(d)(ii)顯示，EV膜通透后，β-actin+EV的種群比例從12.0%增加到52.9%，表明EV膜通透和腔內蛋白標記效率良好。另一方面，對于H3+EV有無進行EV膜透的百分比相當(2.0%vs.1.8%)(圖6(c)(iii)和6(d)(iii))，接近其相應的同型對照水平(圖6(c)(i)和6(d)(i))。此外，對HCT-15細胞的常規(guī)FCM分析顯示，細胞中存在組蛋白H3，并且所使用的單克隆抗體有利于組蛋白H3的標記。因此，這些結果表明，在EV中沒有發(fā)現組蛋白；然而，它們和與EV共分離的非囊泡狀顆粒有關。因此，EV-DNA與組蛋白無關。

七、抗癌藥物誘導DNA+EV數量和個體EV中DNA含量的增加

EV通過從細胞中提取有害的細胞質DNA，在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。據報道，癌細胞分泌的EV比正常細胞釋放的EV攜帶更多的DNA片段。本研究對兩對正常和腫瘤細胞系CCD-18Co和人結直腸癌細胞系HCT-15、人鼻咽癌上皮細胞系NP69和鼻咽癌細胞系C666-1進行EV-DNA比較。通過比較正常細胞和癌細胞分泌的DNA+EVs的數量，發(fā)現癌細胞分泌的DNA+EVs的比例顯著較高(CCD-18Co，35.1±8.4%；HCT-15,57.3%±3.0%；NP69,34.4±5.6%和C666-1,82.7±6.4%)(圖7(a))。經DNaseI處理消化外部EV-DNA后，正常細胞和癌細胞之間的DNA+EV的百分比相當(CCD-18Co，20.1±4.6%；HCT-15,25.2%±1.5%；NP69,20.5±2.2%和C666-1,24.5±6.0%)(圖7(a))。這些數據表明，由于其固有的基因組不穩(wěn)定性，癌細胞比正常細胞分泌更多的DNA+EV，而這種差異主要是由于外部DNA+EV比例的差異。

越來越多的證據表明，抗腫瘤藥物可誘導相當大的染色體不穩(wěn)定和細胞衰老。因此，癌細胞通過釋放大量攜帶更多DNA含量的EV來維持細胞，從而改變其EV分泌譜穩(wěn)態(tài)。為了檢測單EV水平上的EV-DNA變化，我們用基因毒性藥物依托泊苷(拓撲異構酶II抑制劑)(100μM)、SN-38(拓撲異構酶I抑制劑)(10μM)或拓撲替康(拓撲異構酶I抑制劑)(20μM)處理HCT-15細胞。在任何一種藥物治療后，含有DNA的EV數量顯著從對照組的45.8%(0.02%DMSO)顯著增加到依托泊苷、SN-38和拓撲替康的75.1%、71.0%和77.2%(圖7(b))。此外，與個體EV中DNA含量對應的中位FL強度也從對照組的620顯著增加到依托泊苷、SN-38和拓撲替康的2464、1812和1496。這些結果表明，抗癌藥物治療后，單個EV的DNA數量和DNA+EV數量均增加。為了研究藥物治療后內部EV-DNA的變化，在SYTO 16染色前，我們使用DNaseI消化外部EV-DNA。圖7(c)顯示，在兩種藥物治療后，內部DNA+EV的數量顯著增加(0.02%DMSO，24.0%；依托泊苷為36.7%；SN-38為39.6%，拓撲替康為40.5%)。同時，中位FL強度也顯著增加（0.02%DMSO，440；依托泊苷，841；SN-38,980和topotecan，785）。每個處理的三個重復實驗的數據如圖7(d)所示。0.02%DMSO、100μM依托泊苷、10μM SN-38和20μM拓撲替康的DNA+EV的百分比分別為42.0±3.3%、79.2%±2.3%、75.3±3.6%和75.9±4.6%。經DNaseI處理后，0.02%DMSO、100-μM依托泊苷、10-μM SN-38和20-μM拓撲替康的內DNA+EV的百分比分別為22.3±2.4%、36.4%±5.5%、38.9±5.0%和41.9±4.1%。

文章就分享到這里，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Liu Haisheng,Tian Ye,Xue Chengfeng,et al.Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry.Journal of extracellular vesicles.2022;11 (4)：e12206.doi:10.1002/jev2.12206

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37樓2022-08-13 10:35:14
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37樓: Originally posted by NanoFCMlxq at 2022-08-13 10:35:14 多謝支持！我會努力 ...

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