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外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十八）
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今天分享一篇發(fā)表在ACS Sensors（2021年IF=7.711）上的文章，名為《DNA Nanowire Guided-Catalyzed Hairpin Assembly Nanoprobe for In Situ Profifiling of Circulating Extracellular Vesicle-Associated MicroRNAs》[1]（DNA納米線引導(dǎo)催化發(fā)夾組裝納米探針用于循環(huán)胞外囊泡相關(guān)microRNA）。

細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種雙層脂質(zhì)包裹的膜囊泡，直徑從50到200nm，幾乎所有類型的細(xì)胞都會分泌。它們可以通過囊泡內(nèi)生物分子的轉(zhuǎn)移，將生物信息傳遞到目標(biāo)細(xì)胞。MicroRNAs(miRNAs)是一組可以大量封裝在EV(EV-miRNAs)中的小RNA。它們作為基因調(diào)節(jié)因子參與多種生命過程，并與許多疾病相關(guān)。由于脂質(zhì)膜的保護(hù)作用，EV-miRNAs可以在血液和其他體液中穩(wěn)定檢測到，這使它們有望成為一種新型的生物標(biāo)志物。

目前的EV-miRNAs分析通常需要EV裂解和總RNA提取，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析。然而，這些方法還遠(yuǎn)不能令人滿意。除了長時(shí)間的處理時(shí)間和復(fù)雜的操作，實(shí)驗(yàn)所需的EV裂解導(dǎo)致不同程度的RNA降解。此外，多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟會導(dǎo)致RNA的丟失，檢測結(jié)果的重現(xiàn)性較差，這阻礙了EV-miRNAs的準(zhǔn)確定量。EV-miRNAs的原位分析可能為解決上述缺點(diǎn)提供了另一種策略。通過將特定的探針加載到單個(gè)EV中，可以直接從EV內(nèi)的靶向miRNA中檢測到信號，從而避免EV裂解和RNA提取。

有效將檢測探針運(yùn)送到納米級EV中，和與目標(biāo)結(jié)合后的信號放大是該策略的兩個(gè)主要挑戰(zhàn)。目前使用脂質(zhì)體進(jìn)行膜融合或通過物理或化學(xué)方法進(jìn)行膜穿孔的傳遞方法已經(jīng)被提出。然而，脂質(zhì)體是不穩(wěn)定的，嵌入的貨物在進(jìn)入EV之前就被釋放了�；诖┛椎姆椒ǹ赡軙䲟p傷EV膜，并在檢測前導(dǎo)致EV-miRNA泄漏。在信號輸出方面，常用探針如分子信標(biāo)(MBs)或納米片的放大效率較低，導(dǎo)致EV內(nèi)的信號相對較弱，限制了其分析靈敏度。

DNA納米線是由互補(bǔ)序列組成的納米級結(jié)構(gòu)。作為一類一維生物材料，它們可以很容易地被編程并連接到核酸擴(kuò)增系統(tǒng)上。此外，由于DNA的粘性末端被包裹在DNA納米線內(nèi)，它們可以在生物環(huán)境中避免被核酸酶降解。在這里，我們提出了一種DNA納米線引導(dǎo)催化的發(fā)夾組裝(NgCHA)系統(tǒng)，用于原位EV-miRNA的檢測。該策略結(jié)合了DNA納米線的高穿透率和改進(jìn)的催化發(fā)夾組裝(CHA)擴(kuò)增系統(tǒng)在緊湊空間內(nèi)的信號增強(qiáng)，允許快速感知EV-miRNA原位，其性能優(yōu)于傳統(tǒng)的CHA和MB探針。使用EV-miRNA面板(miR-375、miR-1246、miR-221和miR-21)，該系統(tǒng)可以區(qū)分癌癥和非癌癥患者，并通過血液樣本幫助進(jìn)行疾病監(jiān)測（方案1），這顯示了其作為EV分析的非侵入性工具的潛力。

研究結(jié)果：

一、NgCHA納米探針的組裝與表征

為了證明該平臺的原理，我們選擇了miRNA-1246作為模型，該模型在癌癥患者的血漿EV中表達(dá)上調(diào)。NgCHA納米探針與DNA納米線和CHA系統(tǒng)集成(圖1a)。在一個(gè)典型的CHA反應(yīng)中，靶miRNA觸發(fā)了兩個(gè)發(fā)夾(H1和H2)的趾點(diǎn)鏈置換組裝，從而導(dǎo)致靶miRNA和CHA產(chǎn)物的循環(huán)重用(圖2c)。在這項(xiàng)工作中，納米線由觸發(fā)器L1和L2以摩爾比為1：2：2自組裝，這確保了最小長度的更好的EV穿透。CHA的兩個(gè)發(fā)夾被固定在納米線上。然后，將CHA體系(H1和H2)在納米線上交替排列，形成NgCHA納米探針。H1的莖被熒光素酰胺(FAM)和猝滅劑(BHQ1)標(biāo)記，當(dāng)發(fā)夾打開時(shí)，可以產(chǎn)生熒光信號。在加入靶miRNA后，CHA可以沿著納米線啟動。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對NgCHA的組裝過程進(jìn)行了表征。如圖1b所示，CHA可以通過合成的靶標(biāo)miRNA(Lane4)和少量的背景信號(Lane3)成功啟動。將單序列（Lane 1,H1; Lane 2,H2; Lane 5,L1; Lane 6,L2）組合成DNA納米線（Lane 7）和完整的NgCHA（Lane 8）。在Lane 7中，大部分形成了長度約為250bp的DNA納米線，并產(chǎn)生了一些長度在250bp以上的較長的DNA納米線。用瓊脂糖凝膠電泳檢測NgCHA的純度。如圖S1所示，大部分NgCHA納米探針顯示在長度約為380bp的條帶上，在380bp以上形成了一些較長的NgCHA分子。這些結(jié)果證明了NgCHA探針的成功組裝和可接受的純度，并證實(shí)了其檢測miRNAs的可行性。

采用隨時(shí)間變化的熒光信號試驗(yàn)，研究了均相溶液中的反應(yīng)動力學(xué)。加入25nM合成的miRNA-1246后，在515nm處檢測了120min后FAM的熒光恢復(fù)率(圖 1c)。NgCHA產(chǎn)生的時(shí)間依賴性信號增加，直到在30min（黑線）達(dá)到平臺期，遠(yuǎn)短于CHA(90min)。此外，NgCHA顯示出高2.2倍的熒光信號。這些結(jié)果表明，NgCHA納米探針具有較高的靈敏度和效率。

NgCHA較高的熒光信號可以用碰撞理論來解釋：根據(jù)公式V=1/cN(c代表發(fā)夾的濃度，N是阿伏加德羅常數(shù))，當(dāng)?shù)湫偷腃HA發(fā)夾濃度為100nM時(shí)，可反應(yīng)的兩個(gè)發(fā)夾之間最近距離形成的球體體積為1.7×10^(?17)L。在NgCHA系統(tǒng)中，DNA納米線中H1和H2發(fā)夾之間的距離減少到32bp(10.88nm)。在DNA納米線的約束下，最小反應(yīng)體積為5.4×10^(?21)L，CHA的濃度提高到315μM。其反應(yīng)效率是傳統(tǒng)CHA的3150倍(圖 1d)。因此，被DNA納米線局部固定的h1和h2比CHA的碰撞更頻繁，提高了反應(yīng)效率和靈敏度。

二、NgCHA對合成目標(biāo)的分析性能

H1和H2之間的距離在CHA呼吸反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，可能是背景信號的主要原因。因此，我們測試了H1和H2之間的不同距離，并選擇了32bp的最佳距離。然后研究了NgCHA和CHA的檢測性能。NgCHA的熒光強(qiáng)度逐漸增加，增加目標(biāo)從1p M到50nm的檢測極限(LOD)0.8p M(圖2c，d)，比CHA低108倍(圖2e，f)，比分子信標(biāo)低8493倍。為了評估NgCHA的特異性，我們檢測了一個(gè)單堿基錯(cuò)配序列(SBM)、一個(gè)雙堿基錯(cuò)配序列(DBM)、一個(gè)三堿基錯(cuò)配序列(TBM)和一個(gè)完整的錯(cuò)配序列(miRNA-21)。如圖2g所示，只有miRNA-1246可以啟動該反應(yīng)。對于癌癥分析，通常需要多個(gè)miRNA；因此，我們進(jìn)一步評估了NgCHA在多重miRNA中的分析性能。我們設(shè)計(jì)了4個(gè)NgCHA納米探針用于miRNAs的正交鑒定(miR-221、miR-375、miR-1246和miR-21)(圖2h)。NgCHA在添加靶miRNAs時(shí)產(chǎn)生的信號要比在添加非靶miRNAs時(shí)產(chǎn)生的信號要高得多。這些結(jié)果證明了NgCHA的多功能性，并支持其用于進(jìn)一步的癌癥管理。接下來，通過在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和批間試驗(yàn)中檢測1nM和0.01nM的miR-1246樣品，來評價(jià)該方法的重現(xiàn)性。批內(nèi)和批間變量系數(shù)分別為1.83%和5.89%。這些結(jié)果表明，該熒光平臺具有出色的重現(xiàn)性。通過與陰性的人血漿進(jìn)行孵育，驗(yàn)證了該探針的穩(wěn)定性。熒光試驗(yàn)和瓊脂糖電泳試驗(yàn)結(jié)果均表明，NgCHA納米探針比傳統(tǒng)的DNA探針更穩(wěn)定，這可能是由于DNA納米線對DNA探針的保護(hù)作用。

三、NgCHA原位檢測EVmiRNA的分析性能

采用標(biāo)準(zhǔn)超離心法從三種不同的乳腺癌(BC)細(xì)胞系(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR3)和一個(gè)良性乳腺上皮細(xì)胞系(MCF-10A)中提取的EV用于檢測。透射電子顯微鏡(TEM)圖像展示了一個(gè)具有凹形的橢圓形EV結(jié)構(gòu)。Western blot分析顯示了四種EV蛋白(CD9、CD81、CD63和TSG101)的特異性表達(dá)。納米顆粒跟蹤分析(NTA)顯示，顆粒粒徑在76~225nm之間，置信度為95%。這些結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的EV的結(jié)果一致，表明所獲得的EV是完整的，可用于接下來的實(shí)驗(yàn)。

為了證實(shí)NgCHA進(jìn)行原位分析的可行性，我們將NgCHA與不同濃度的MDAMB-231細(xì)胞來源的EV一起孵育。加入EV后，熒光信號逐漸增加，這顯示了隨機(jī)納米探針的差異。利用超分辨率熒光顯微鏡對NgCHA(FAM)和EV(PKH26)的共定位也表明，NgCHA納米探針進(jìn)入了EV管腔(圖3a)。為了進(jìn)一步確認(rèn)熒光信號的來源，我們采用了國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(ISEV)推薦的樣品制備方法。用蛋白酶K和RNase完全降解miRNA和蛋白?miRNA復(fù)合物，它們可能結(jié)合EV表面。合成miR-1246的NgCHA探針產(chǎn)生的熒光信號在樣品處理后下降到陰性對照水平。當(dāng)使用MDA-MB-231細(xì)胞來源的EV的樣品制備時(shí)，與未處理的EV相比，熒光強(qiáng)度略有下降(圖3b)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了NgCHA納米探針可用于直接檢測EV-miRNA。此外，熒光信號與EV濃度明顯相關(guān)，在濃度低至2×106顆粒/μL時(shí)，與空白探針有顯著差異(圖3c)。NgCHA孵育的EV的代表性的納米流式（NanoFCM）分析顯示，信號明顯強(qiáng)于其他組(EV組，EV與CHA孵育的組)。這些結(jié)果證明了NgCHA納米探針對原位檢測EV-miRNA的靈敏度。以下原因可能與NgCHA的內(nèi)化機(jī)制有關(guān)。首先，NgCHA的剛性結(jié)構(gòu)可以大大提高細(xì)胞的攝取效率，這已經(jīng)在之前的報(bào)道中得到了證實(shí)。其次，NgCHA納米探針的角落可以基于“類電荷吸引”機(jī)制促進(jìn)其傳遞。

為了研究該平臺的檢測準(zhǔn)確性，我們用NgCHA納米探針檢測了來自MDAMB-231、MCF-7、SK-BR3和MCF-10A細(xì)胞系的EV中EV-miRNAs的水平和實(shí)時(shí)(RT)-qPCR。來自MDA-MB-231細(xì)胞系的EV的熒光信號比來自MCF-7、SK-BR-3和MCF-10A細(xì)胞的EV的熒光信號分別高約1.6倍、2.0倍和2.2倍(圖3d)。此外，線性回歸分析表明，NgCHA結(jié)果與RT-qPCR獲得的數(shù)據(jù)高度成正比，相關(guān)系數(shù)為0.983(圖3e)。

四、四種用于BC診斷和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估的EV-miRNA圖譜

接下來，我們用真實(shí)的臨床樣本評估了該平臺的性能。我們選擇了一些假定的與腫瘤相關(guān)的EV-miRNA來在EV上進(jìn)行檢測。MiR-21是一種癌癥生物標(biāo)志物，因?yàn)樗诟鞣N癌癥中都表達(dá)上調(diào)。研究表明，miRNA-21通過抑制腫瘤抑制基因來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。miR-1246也被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌和其他癌癥中過表達(dá)。它在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。MiR-221參與抑制基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27和雌激素受體(ER)，通過干擾正常的細(xì)胞增殖過程導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。MiR-375也被確定為ER的調(diào)節(jié)因子和治療的潛在預(yù)測因子。miR-375的高表達(dá)可通過抑制p27和ER而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。在公共數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證后，我們使用了4-EV-miRNAs(miR-221、miR-375、miR-1246和miR-21)作為我們的候選生物標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈冊诟鞣N腫瘤中的高表達(dá)。

然后，我們測試了所提出的平臺是否可以用于BC診斷。共收集了36例未經(jīng)治療的BC患者（n=21，早期=12，晚期=9）和健康供體(HD)（n=15）的血漿樣本，并通過4個(gè)EV-miRNA面板進(jìn)行分析。如圖4a所示，四種EV-miRNA在不同患者中的表達(dá)水平差異很大。根據(jù)從36個(gè)臨床樣本中測量的4個(gè)EV-miRNAs的散射圖(圖4b)，對于BC患者和HD，EV-miR-1246、EV-miR-375、EV-miR-221和EV-miR-21的差異明顯。證明了EV-miRNA可用于區(qū)分BC和HD。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析來評估個(gè)體EV-miRNAs區(qū)分BC患者和HDs的能力。如圖4c所示，EV-miRNAs組合后的曲線下面積(AUC)顯著改善，而EV-miR-1246、EV-miR-375、EV-miR-221和EV-miR-21的AUC分別為0.894、0.746、0.810和0.875。與單一EV-miRNA和其他EV-miRNA組合相比，4種EV-miRNA組合提供了最好的準(zhǔn)確性(AUC：0.965,95%CI：0.942-1.000)(圖4c)。值得注意的是，4種EV-miRNAs聯(lián)合治療在乳腺癌早期的AUC為0.945，敏感性和特異性分別為95%和100%(圖4c)，提示所提出的BC診斷平臺具有較高的臨床可行性。

手術(shù)治療是BC患者的主要治療方法之一。手術(shù)治療后，通過臨床綜合分析來評估BC患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，確定對患者的隨訪治療方案。因此，我們評估了EV-miRNA分析結(jié)合隨機(jī)森林算法(RF)的能力，這是一種新興的和高度靈活的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，以評估從手術(shù)治療后收集的BC患者的78個(gè)血漿樣本的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。圖5a總結(jié)了高危(HR)（n=23）、中風(fēng)險(xiǎn)(Mr)（n=38）和低風(fēng)險(xiǎn)(LR)（n=17）患者EV-miRNA表達(dá)水平的相對變化，這些患者均被臨床估計(jì)證實(shí)。對訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果進(jìn)行了定量總結(jié)，形成了混淆矩陣(圖5b，c)。采用RF方法進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估，訓(xùn)練隊(duì)列的總體準(zhǔn)確率為87%，驗(yàn)證隊(duì)列中為82%。EV-miR-1246在癌癥分類中所占比例高于EV-miR-1246，說明EV-miRNA-1246在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估中的重要作用。

五、提出了區(qū)分多種癌癥的平臺

該平臺在BC管理中的良好性能促使我們進(jìn)一步探索其在癌癥分析中的實(shí)用性。不同腫瘤來源的治療方法不同，目前的方法很難區(qū)分晚期患者的腫瘤來源。因此，識別腫瘤類型對于評價(jià)腫瘤來源和有效治療腫瘤具有重要價(jià)值。在這項(xiàng)工作中，我們使用EV-miRNA面板結(jié)合射頻驗(yàn)證腫瘤類型分化在臨床隊(duì)列覆蓋一系列腫瘤類型的可能性，包括BC(n=21例)，肝癌(n=21例)，肺癌(n=21例)，胃癌(n=21例)和結(jié)直腸癌(n=21例)。EV-miRNA圖譜在訓(xùn)練隊(duì)列中通過RF進(jìn)行處理，并在驗(yàn)證隊(duì)列中得到證實(shí)。通過使用t-SNE將RF的性能映射到一個(gè)二維平面上，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不同類型的腫瘤都是分離的(圖6a)。根據(jù)基于訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列(圖6b)的混淆矩陣，該模型在識別BC和肺癌方面具有較好的準(zhǔn)確性，而對肝癌和結(jié)腸直腸癌的識別準(zhǔn)確性較低。在多類癌癥診斷中，訓(xùn)練隊(duì)列的總體準(zhǔn)確率為62%，驗(yàn)證隊(duì)列的總體準(zhǔn)確率為58%，優(yōu)于驗(yàn)證隊(duì)列中的其他機(jī)器學(xué)習(xí)算法(NN35%，SVM32%，LDA38%)。它的準(zhǔn)確性也與之前報(bào)道的8-EV蛋白面板相當(dāng)。這些結(jié)果表明，所提出的模型能夠很好地區(qū)分腫瘤類型。雖然EV-miR-1246具有最高的相對重要性，但其他EV-miRNA的相對重要性不低于20%，表明了每個(gè)EV-miRNA在多類癌癥診斷中不可或缺的作用。因此，EV-miRNA譜結(jié)合RF可以幫助分類癌癥類型，支持疾病診斷，從而對原發(fā)腫瘤來源不明的癌癥患者實(shí)現(xiàn)更有效的治療。

總結(jié)：

總的來說，我們開發(fā)了一種新型的NgCHA納米探針，用于原位分析EV-miRNA，并展示了其在臨床樣本中的應(yīng)用。通過將DNA納米線與CHA系統(tǒng)連接起來，NgCHA能夠直接檢測具有高穩(wěn)定性和高滲透性的EV-miRNA。DNA納米線在緊湊空間內(nèi)的CHA系統(tǒng)通過增加局部濃度進(jìn)一步提高了分子碰撞概率，具有比傳統(tǒng)CHA和MB納米探針的靈敏度。通過EV-miRNA面板的結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)可以成功地實(shí)現(xiàn)BC診斷、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評估和多種癌癥的鑒別。與目前的RT-qPCR方法需要操作復(fù)雜、終點(diǎn)檢測相比，該方法具有操作簡單、實(shí)時(shí)監(jiān)測、成本低等優(yōu)點(diǎn)。此外，它還可與臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的常用酶標(biāo)儀集成。它也可以很容易地用不同的發(fā)夾進(jìn)行編程，用于檢測其他與疾病相關(guān)的核酸。我們假設(shè)這種方法在基于EV的疾病管理中具有很大的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang Ye,Wu Yuan,Luo Shihua,et al.DNA Nanowire Guided-Catalyzed Hairpin Assembly Nanoprobe for In Situ Profiling of Circulating Extracellular Vesicle-Associated MicroRNAs.ACS sensors.2022;7 (4)：1075-1085.doi:10.1021/acssensors.1c02717

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gordon3992樓
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yongde10樓
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hzx914樓
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