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專業(yè): 細胞生物學研究中的新方法

[交流] 外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（十五）已有1人參與

今天分享一篇發(fā)表在ACS Nano（2021年IF=15.881）上的文章，名為《Protein Profifiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry》[1]（流式檢測結直腸癌患者細胞外囊泡的蛋白表達和粒徑）。

細胞外囊泡(EVs)是一種由幾乎所有細胞自然分泌的納米級膜囊泡，通過RNA和蛋白質等大分子的轉移來介導細胞間的通信。這些囊泡由于其越來越多的病理生理學作用和作為診斷和治療工具的潛在用途，已激發(fā)了相當大的科學和臨床研究者的興趣。EV的表面蛋白在反映其亞細胞來源和供體細胞類型方面發(fā)揮重要作用，指導它們被受體細胞靶向和捕獲，保護它們免受吞噬以減少循環(huán)清除。因此，EV的蛋白譜對于理解EV功能、區(qū)分疾病相關亞型、預測轉移傾向和確定未來轉移的器官部位和評估基于EV的藥物傳遞系統(tǒng)的質量是必不可少的。然而，EV從不同的細胞類型(甚至從一種細胞類型)在大小和表面蛋白上高度異質，特定的囊泡亞型可能單獨負責特定的功能。如果使用Western blot和ELISA進行分析，這一獨特的子集很容易被其他豐富的EV所掩蓋。因此，迫切需要一種靈敏、高特異性和快速的方法來在單粒子水平上測量EV上這些蛋白質標記物的豐度。

EV的生物發(fā)生途徑主要分為外泌體(30?100nm)和微囊泡(100?1000nm)，由晚期內吞小體（被稱為多囊泡體）釋放或從細胞的質膜中出芽。目前確認和量化單個EV上特異性蛋白表達的方法是使用金標記抗體的免疫電鏡(IEM)，但由于程序繁瑣，統(tǒng)計能力有限，很難常規(guī)應用。雖然流式細胞術(FCM)已經(jīng)被應用于利用熒光閾值觸發(fā)分析單個EV的表面蛋白，但專用FCM最小可檢測囊泡大小為150?190nm，傳統(tǒng)FCM為270?600nm。利用鞘流中的單分子熒光檢測策略，我們開發(fā)了高靈敏度流式檢測技術(HSFCM)，可以使光散射檢測直徑分別為24nm和27nm的單個二氧化硅納米顆粒和病毒。在本次研究中，我們報道了一種超靈敏的基于流式檢測的方法，用于蛋白分析和將單個EV的檢測下限降低到40nm。通過免疫熒光染色和單粒子計數(shù)來定量表達特異性蛋白的EV亞群。通過分析結直腸癌患者無血小板血漿(PFP)中CD147陽性EV的顆粒濃度，研究了不同的EV亞群在疾病診斷和治療監(jiān)測中的潛力。

研究結果：

一、高靈敏度流式檢測技術的單EV分析和純度評估

來自細胞的EV的兩種分泌途徑如圖1a所示。因為傳統(tǒng)的用于分離外泌體或微囊泡的方案通常共分離混合群體的EV，在本研究中，我們通過超離從人細胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基中分離EV(圖1b)。圖1c顯示了從人結直腸癌細胞系HCT15培養(yǎng)上清中分離的EV的典型冷凍透射電鏡圖像，并且確定了顆粒的大小和形貌具有很大的異質性。為了能夠對單個EV進行多參數(shù)分析，原來的實驗室建造的雙通道HSFCM被升級，配備了三個單光子計數(shù)雪崩光電二極管(APD)探測器，用于同時檢測側散射(SSC)和雙色熒光(圖1d)。與傳統(tǒng)的FCM相比，為減少背景，探測區(qū)體積縮小到fL級別(～25fL)，延長納米粒子在激光束中的停留時間以增強光子的產生，以及單光子計數(shù)APD的高量子產率是HSFCM實現(xiàn)顯著提高靈敏度的關鍵。從錐形毛細管中流出的樣品流(40μm i.d. 和240μm o.d.)由鞘流體水動力聚焦到一個非常細的流(～1.4μm)，穿過聚焦激光束的中心區(qū)域(直徑～16μm)。圖1e(i)顯示了通過220nm濾光片的PBS的典型SSC信號，雜質粒子的個數(shù)為2?4 events/s。對于從結直腸癌細胞系HCT15中分離出來的EV，我們觀察到散射光強度有很大的變化(圖1e(ii))。有個別大尺寸納米顆粒的散射信號飽和了探測器（用實心倒三角形標記▼表示）。圖1f描述了SSC爆發(fā)面積分布直方圖，由PBS（紅線）和EV（黑線）分別收集超過2min的數(shù)據(jù)的分布直方圖。EV非常廣泛的SSC分布反映了它們在粒徑上的巨大內在異質性。

EV的高質量純化對于下游生化分析的準確性至關重要，如蛋白質組學分析和EV介導的功能mRNA和miRNAs的轉移。由于脂蛋白和其他一些污染物不可避免地在分離物中共存，因此評估EV的純度很重要。我們使用TritonX-100裂解EV的磷脂膜，并檢測了處理前后的顆粒。圖1g(i)和(ii)顯示了在1%TritonX-100處理1小時之前和之后，EV的典型SSC信號分布。在洗滌劑處理后，EV的顆粒數(shù)顯著降低。我們確定，從不同細胞系的細胞培養(yǎng)上清中分離的EV含有85?90%的膜囊，而從PFP中分離的EV由于血漿中存在大量的脂蛋白顆粒，這一比例下降到70%(圖1h)。

二、EV的高分辨率尺寸分布分析

EV的顆粒大小和分布是影響細胞攝取的重要物理特性，包括細胞間的通信和治療效率。在這里，我們比較了HSFCM與冷凍透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析(NTA)對EV粒徑分布分析的影響。為了獲得高質量的EV大小分布，通過80張冷凍透射電鏡分析1000多個囊泡，對HCT15細胞分離物進行了表征。尺寸分布曲線如圖2a所示，箱寬為10nm。雖然尺寸分布在30~600nm之間，但大約65%的囊泡在30?100nm的尺寸范圍內，86%的囊泡在30?200nm的尺寸范圍內。EV的峰值位置和中值大小分別為55nm和75nm。為了檢驗HSFCM在EV絕對尺寸分布分析中的性能，我們合成了一系列單分散二氧化硅納米顆粒(SiNPs)，并作為尺寸參考標準。圖2b顯示了47、59、74、94和123nm SiNPs混合物的SSC分布直方圖。為了糾正SiNPs（1.461）和EV（1.400）之間輕微折射率差異引起的偏差，根據(jù)Mie理論計算導出了每種大小的SSC強度的校正因子。當從擬合的高斯曲線中得到的SSC強度的質心對SiNPs的每個大小總體進行校正時，得到了散射光強度和粒子大小的校準曲線，其大小依賴性為5.01階(圖2c)。因此，EV樣品的SSC分布直方圖(圖1f)可以轉換為粒徑分布，bin寬度設置為1nm(圖2d)。顯然，通過HSFCM可以測量到小至40nm的單個EV。請注意，大于175nm的EV在當前儀器設置下飽和了探測器。盡管如此，在對EV樣品的2min中檢測到的10720 個事件中，飽和檢測器的峰數(shù)被確定為98個。因此，99%以上的EV群可以通過HSFCM準確表征。測量到的EV的峰值位置和中值尺寸分別為50和64.5nm。NTA還對這五種不同尺寸的SiNPs和EV樣品進行了平行分析，其粒徑分布直方圖分別如圖2e和圖2f所示。與HSFCM對5個SiNPs群體的基線分離相比，由于嚴重的峰值展寬，在NTA上獲得的大小分布曲線中觀察到顯著的重疊(圖2e)。EV樣品測量的峰位置和中值大小分別為105和107.6nm，與冷凍透射電鏡和HSFCM測量的相應值有較大偏差。

三、個體EV的蛋白分析

由于目前還沒有基于其生物發(fā)生來分離EV的純化方法，因此EV每個亞群的比例不清楚，往往會導致不一致的結果。從HCT15細胞培養(yǎng)上清中分離的EV用常用的外泌體標記物CD9、CD63、CD81偶聯(lián)單克隆抗體染色。由于HSFCM可以檢測到與PE偶聯(lián)的單一抗體，我們推斷免疫染色的單個EV應該很容易被檢測到。PE熒光與SSC的雙變量點圖如圖3a所示。10萬g超離心回收的EV，CD9、CD63、CD81檢測到陽性率分別為55.2%、46.0%和55.0%。通過校準PE熒光強度與單個PE偶聯(lián)單克隆抗體的熒光強度中位數(shù)，可以得到每個EV上結合的單克隆抗體的數(shù)量。根據(jù)單抗與抗原的1：1結合比，可以得到單個EV上表達的CD9、CD63、CD81的拷貝數(shù)分布，如圖3b i?iii所示。結果表明，對于表面有特異性蛋白表達的EV，每個EV上CD9、CD63和CD81的中位數(shù)拷貝數(shù)分別僅為5、6和5。這些結果與文獻中報道的關于免疫金標記的代表性TEM圖像很一致，盡管經(jīng)典的TEM方法缺乏統(tǒng)計學上的嚴謹性。同時，EV中CD9、CD63和CD81的蛋白水平分析采用傳統(tǒng)的流式細胞儀(BD FACSAriaIII)，將EV與4μm醛/硫酸乳膠珠孵育和以及與特定的偶聯(lián)PE的單抗染色。與基于磁珠捕獲的分析方法相比，HSFCM的單顆粒分析不僅可以揭示表達特定蛋白質的EV亞群百分比，而且還可以揭示EV亞群內蛋白質拷貝數(shù)的分布。值得注意的是，對于EV的IgG-PE結合物的大尺寸可能限制了可以與給定EV結合的探針的數(shù)量。此外，抗原聚類可能使igG-抗原結合的空間位阻的情況更糟糕。如果探針可以用有機染料標記的小配體取代，如抗原結合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、附著體或適配體，測定的抗原表達拷貝數(shù)可能更準確。

然而，為了研究CD9、CD63和CD81在單個囊泡表面的共表達，我們采用雙免疫熒光染色法分析了相同的EV樣本。圖3c顯示了PerCP-Cy5.5紅色熒光與PE橙色熒光的雙變量點圖。共表達CD9/CD81、CD63/CD81和CD9/CD63的EV亞群分別為31.8%、31.1%和22.3%。除了共同表達兩種蛋白的EV群體的自然減少外，由于空間位阻，也可導致兩種蛋白的低效免疫熒光標記陽性率降低。

四、結直腸癌細胞系中CD147陽性EV的分析

盡管使用EV作為癌癥診斷的生物標志物的潛力一直很有前景，但臨床樣本中特異性EV亞型的定量仍然具有挑戰(zhàn)性。CD147是一種對乳酸轉運很重要的跨膜蛋白，在某些人類腫瘤類型中過表達。最近，從結直腸癌細胞系中分離的EV中證實了高水平的CD147表達，并使用光敏化珠檢測了從結直腸癌中分離的循環(huán)CD147/CD9雙陽性EV。在這里，我們應用HSFCM分析了從結直腸癌細胞系(HCT15和HCT116)和正常結腸成纖維細胞系(CCD-18Co)中分離的EV上CD147的表達（圖4）。從不同細胞系分離的EV的CD147 PE熒光與SSC的雙變量點圖表明，CCD-18Co細胞分泌的只有不到10%的EV群體CD147陽性(圖4a)，而結直腸癌細胞系的則接近50%(圖4b，c)。來自癌細胞系的EV的CD147表達水平的升高表明了其在癌癥診斷中的潛在應用價值。HSFCM提供了幾個比傳統(tǒng)的分析方法優(yōu)勢：Western blot分析顯示了樣品中相對的蛋白量(圖4d)，HSFCM還揭示了表達CD147的EV的百分比，并可以在單粒子水平上將蛋白質豐度與囊泡大小相關聯(lián)。例如，CD147陽性的EV根據(jù)其細胞來源表現(xiàn)出不同的大小分布，例如，HCT15細胞的尺寸小，HCT116細胞的尺寸大（圖4）。

五、結直腸癌患者及健康供體血漿中CD147陽性EV的分析

結直腸癌的死亡率為40%?50%，早期診斷已給予適當?shù)脑缙诟深A至關重要。由于CD147水平在正常和癌細胞系中存在差異(圖4d)，我們試圖確定CD147水平是否可以用于區(qū)分從結直腸癌患者（n=37）和健康人（n=32）血液樣本中分離的EV（表1）。分離過程如圖1b所示，僅需50μL的PFP就足以進行HSFCM分析。我們首先使用羅丹明B異硫氰酸酯(RBITC)封裝的直徑80nm的熒光SiNPs測量血漿中的顆粒濃度（圖5a）。我們發(fā)現(xiàn)，癌癥患者和健康人的血漿濃度在不同個體間可相差40-50倍，而平均EV濃度沒有顯著差異（圖5b和表2）。然后，我們用PE偶聯(lián)抗體熒光染色分析CD147陽性EV的顆粒濃度。圖5c顯示了從患者樣本中分離出的EV的PE熒光與SSC的雙變量點圖，其中CD147陽性的EV為15.4%。使用已知顆粒濃度的100nm橙色熒光球來校準樣品流速，測量CD147陽性EV的血漿濃度。29圖5d顯示，健康供體CD147陽性EV的平均濃度為（4.1±2.3）×10^7顆粒/mL，結直腸癌患者的平均濃度為（2.9±2.9）×10^8顆粒/mL，有差異顯著(P<0.001)。圖6所示的ROC曲線顯示，CD147陽性EV（來自結直腸癌患者和健康供體）的濃度顯示了一個優(yōu)秀的分類器，AUC為0.932。同時，在所有癌癥期患者中，甚至是I期患者中，均發(fā)現(xiàn)CD147陽性EV水平升高(圖5e)。這些結果表明，CD147陽性EV的顆粒濃度可能有助于結直腸癌的早期診斷。在術前和術后（術后第7天?10天）分析血液樣本時，16例結直腸癌患者中有13例在手術切除后CD147陽性EV的顆粒濃度顯著下降(P<0.05)(圖5f)。雖然還需要更多臨床樣本，以進一步驗證使用CD147陽性EV進行結直腸癌診斷和治療監(jiān)測的可行性，這一結果表明，使用疾病特異性EV亞群的顆粒濃度在診斷和預后方面具有巨大的潛力。

文章就分享到這里，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Tian, Y; Ma, L; Gong, M; et al.Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry.[J].ACS Nano.2018,12(1):671-680

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