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NanoFCMlxq新蟲 (正式寫手)
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[交流]
外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十五） 已有1人參與
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今天分享一篇發(fā)表在ACS Nano（2021年IF=15.881）上的文章，名為《Protein Profifiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry》[1]（流式檢測結(jié)直腸癌患者細(xì)胞外囊泡的蛋白表達(dá)和粒徑）。 細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種由幾乎所有細(xì)胞自然分泌的納米級膜囊泡，通過RNA和蛋白質(zhì)等大分子的轉(zhuǎn)移來介導(dǎo)細(xì)胞間的通信。這些囊泡由于其越來越多的病理生理學(xué)作用和作為診斷和治療工具的潛在用途，已激發(fā)了相當(dāng)大的科學(xué)和臨床研究者的興趣。EV的表面蛋白在反映其亞細(xì)胞來源和供體細(xì)胞類型方面發(fā)揮重要作用，指導(dǎo)它們被受體細(xì)胞靶向和捕獲，保護(hù)它們免受吞噬以減少循環(huán)清除。因此，EV的蛋白譜對于理解EV功能、區(qū)分疾病相關(guān)亞型、預(yù)測轉(zhuǎn)移傾向和確定未來轉(zhuǎn)移的器官部位和評估基于EV的藥物傳遞系統(tǒng)的質(zhì)量是必不可少的。然而，EV從不同的細(xì)胞類型(甚至從一種細(xì)胞類型)在大小和表面蛋白上高度異質(zhì)，特定的囊泡亞型可能單獨(dú)負(fù)責(zé)特定的功能。如果使用Western blot和ELISA進(jìn)行分析，這一獨(dú)特的子集很容易被其他豐富的EV所掩蓋。因此，迫切需要一種靈敏、高特異性和快速的方法來在單粒子水平上測量EV上這些蛋白質(zhì)標(biāo)記物的豐度。 EV的生物發(fā)生途徑主要分為外泌體(30?100nm)和微囊泡(100?1000nm)，由晚期內(nèi)吞小體（被稱為多囊泡體）釋放或從細(xì)胞的質(zhì)膜中出芽。目前確認(rèn)和量化單個EV上特異性蛋白表達(dá)的方法是使用金標(biāo)記抗體的免疫電鏡(IEM)，但由于程序繁瑣，統(tǒng)計能力有限，很難常規(guī)應(yīng)用。雖然流式細(xì)胞術(shù)(FCM)已經(jīng)被應(yīng)用于利用熒光閾值觸發(fā)分析單個EV的表面蛋白，但專用FCM最小可檢測囊泡大小為150?190nm，傳統(tǒng)FCM為270?600nm。利用鞘流中的單分子熒光檢測策略，我們開發(fā)了高靈敏度流式檢測技術(shù)(HSFCM)，可以使光散射檢測直徑分別為24nm和27nm的單個二氧化硅納米顆粒和病毒。在本次研究中，我們報道了一種超靈敏的基于流式檢測的方法，用于蛋白分析和將單個EV的檢測下限降低到40nm。通過免疫熒光染色和單粒子計數(shù)來定量表達(dá)特異性蛋白的EV亞群。通過分析結(jié)直腸癌患者無血小板血漿(PFP)中CD147陽性EV的顆粒濃度，研究了不同的EV亞群在疾病診斷和治療監(jiān)測中的潛力。 研究結(jié)果： 一、高靈敏度流式檢測技術(shù)的單EV分析和純度評估 來自細(xì)胞的EV的兩種分泌途徑如圖1a所示。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的用于分離外泌體或微囊泡的方案通常共分離混合群體的EV，在本研究中，我們通過超離從人細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基中分離EV(圖1b)。圖1c顯示了從人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT15培養(yǎng)上清中分離的EV的典型冷凍透射電鏡圖像，并且確定了顆粒的大小和形貌具有很大的異質(zhì)性。為了能夠?qū)蝹�EV進(jìn)行多參數(shù)分析，原來的實(shí)驗(yàn)室建造的雙通道HSFCM被升級，配備了三個單光子計數(shù)雪崩光電二極管(APD)探測器，用于同時檢測側(cè)散射(SSC)和雙色熒光(圖1d)。與傳統(tǒng)的FCM相比，為減少背景，探測區(qū)體積縮小到fL級別(～25fL)，延長納米粒子在激光束中的停留時間以增強(qiáng)光子的產(chǎn)生，以及單光子計數(shù)APD的高量子產(chǎn)率是HSFCM實(shí)現(xiàn)顯著提高靈敏度的關(guān)鍵。從錐形毛細(xì)管中流出的樣品流(40μm i.d. 和240μm o.d.)由鞘流體水動力聚焦到一個非常細(xì)的流(～1.4μm)，穿過聚焦激光束的中心區(qū)域(直徑～16μm)。圖1e(i)顯示了通過220nm濾光片的PBS的典型SSC信號，雜質(zhì)粒子的個數(shù)為2?4 events/s。對于從結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT15中分離出來的EV，我們觀察到散射光強(qiáng)度有很大的變化(圖1e(ii))。有個別大尺寸納米顆粒的散射信號飽和了探測器（用實(shí)心倒三角形標(biāo)記▼表示）。圖1f描述了SSC爆發(fā)面積分布直方圖，由PBS（紅線）和EV（黑線）分別收集超過2min的數(shù)據(jù)的分布直方圖。EV非常廣泛的SSC分布反映了它們在粒徑上的巨大內(nèi)在異質(zhì)性。 EV的高質(zhì)量純化對于下游生化分析的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，如蛋白質(zhì)組學(xué)分析和EV介導(dǎo)的功能mRNA和miRNAs的轉(zhuǎn)移。由于脂蛋白和其他一些污染物不可避免地在分離物中共存，因此評估EV的純度很重要。我們使用TritonX-100裂解EV的磷脂膜，并檢測了處理前后的顆粒。圖1g(i)和(ii)顯示了在1%TritonX-100處理1小時之前和之后，EV的典型SSC信號分布。在洗滌劑處理后，EV的顆粒數(shù)顯著降低。我們確定，從不同細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離的EV含有85?90%的膜囊，而從PFP中分離的EV由于血漿中存在大量的脂蛋白顆粒，這一比例下降到70%(圖1h)。 二、EV的高分辨率尺寸分布分析 EV的顆粒大小和分布是影響細(xì)胞攝取的重要物理特性，包括細(xì)胞間的通信和治療效率。在這里，我們比較了HSFCM與冷凍透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析(NTA)對EV粒徑分布分析的影響。為了獲得高質(zhì)量的EV大小分布，通過80張冷凍透射電鏡分析1000多個囊泡，對HCT15細(xì)胞分離物進(jìn)行了表征。尺寸分布曲線如圖2a所示，箱寬為10nm。雖然尺寸分布在30~600nm之間，但大約65%的囊泡在30?100nm的尺寸范圍內(nèi)，86%的囊泡在30?200nm的尺寸范圍內(nèi)。EV的峰值位置和中值大小分別為55nm和75nm。為了檢驗(yàn)HSFCM在EV絕對尺寸分布分析中的性能，我們合成了一系列單分散二氧化硅納米顆粒(SiNPs)，并作為尺寸參考標(biāo)準(zhǔn)。圖2b顯示了47、59、74、94和123nm SiNPs混合物的SSC分布直方圖。為了糾正SiNPs（1.461）和EV（1.400）之間輕微折射率差異引起的偏差，根據(jù)Mie理論計算導(dǎo)出了每種大小的SSC強(qiáng)度的校正因子。當(dāng)從擬合的高斯曲線中得到的SSC強(qiáng)度的質(zhì)心對SiNPs的每個大小總體進(jìn)行校正時，得到了散射光強(qiáng)度和粒子大小的校準(zhǔn)曲線，其大小依賴性為5.01階(圖2c)。因此，EV樣品的SSC分布直方圖(圖1f)可以轉(zhuǎn)換為粒徑分布，bin寬度設(shè)置為1nm(圖2d)。顯然，通過HSFCM可以測量到小至40nm的單個EV。請注意，大于175nm的EV在當(dāng)前儀器設(shè)置下飽和了探測器。盡管如此，在對EV樣品的2min中檢測到的10720 個事件中，飽和檢測器的峰數(shù)被確定為98個。因此，99%以上的EV群可以通過HSFCM準(zhǔn)確表征。測量到的EV的峰值位置和中值尺寸分別為50和64.5nm。NTA還對這五種不同尺寸的SiNPs和EV樣品進(jìn)行了平行分析，其粒徑分布直方圖分別如圖2e和圖2f所示。與HSFCM對5個SiNPs群體的基線分離相比，由于嚴(yán)重的峰值展寬，在NTA上獲得的大小分布曲線中觀察到顯著的重疊(圖2e)。EV樣品測量的峰位置和中值大小分別為105和107.6nm，與冷凍透射電鏡和HSFCM測量的相應(yīng)值有較大偏差。 三、個體EV的蛋白分析 由于目前還沒有基于其生物發(fā)生來分離EV的純化方法，因此EV每個亞群的比例不清楚，往往會導(dǎo)致不一致的結(jié)果。從HCT15細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離的EV用常用的外泌體標(biāo)記物CD9、CD63、CD81偶聯(lián)單克隆抗體染色。由于HSFCM可以檢測到與PE偶聯(lián)的單一抗體，我們推斷免疫染色的單個EV應(yīng)該很容易被檢測到。PE熒光與SSC的雙變量點(diǎn)圖如圖3a所示。10萬g超離心回收的EV，CD9、CD63、CD81檢測到陽性率分別為55.2%、46.0%和55.0%。通過校準(zhǔn)PE熒光強(qiáng)度與單個PE偶聯(lián)單克隆抗體的熒光強(qiáng)度中位數(shù)，可以得到每個EV上結(jié)合的單克隆抗體的數(shù)量。根據(jù)單抗與抗原的1：1結(jié)合比，可以得到單個EV上表達(dá)的CD9、CD63、CD81的拷貝數(shù)分布，如圖3b i?iii所示。結(jié)果表明，對于表面有特異性蛋白表達(dá)的EV，每個EV上CD9、CD63和CD81的中位數(shù)拷貝數(shù)分別僅為5、6和5。這些結(jié)果與文獻(xiàn)中報道的關(guān)于免疫金標(biāo)記的代表性TEM圖像很一致，盡管經(jīng)典的TEM方法缺乏統(tǒng)計學(xué)上的嚴(yán)謹(jǐn)性。同時，EV中CD9、CD63和CD81的蛋白水平分析采用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaIII)，將EV與4μm醛/硫酸乳膠珠孵育和以及與特定的偶聯(lián)PE的單抗染色。與基于磁珠捕獲的分析方法相比，HSFCM的單顆粒分析不僅可以揭示表達(dá)特定蛋白質(zhì)的EV亞群百分比，而且還可以揭示EV亞群內(nèi)蛋白質(zhì)拷貝數(shù)的分布。值得注意的是，對于EV的IgG-PE結(jié)合物的大尺寸可能限制了可以與給定EV結(jié)合的探針的數(shù)量。此外，抗原聚類可能使igG-抗原結(jié)合的空間位阻的情況更糟糕。如果探針可以用有機(jī)染料標(biāo)記的小配體取代，如抗原結(jié)合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)、附著體或適配體，測定的抗原表達(dá)拷貝數(shù)可能更準(zhǔn)確。 然而，為了研究CD9、CD63和CD81在單個囊泡表面的共表達(dá)，我們采用雙免疫熒光染色法分析了相同的EV樣本。圖3c顯示了PerCP-Cy5.5紅色熒光與PE橙色熒光的雙變量點(diǎn)圖。共表達(dá)CD9/CD81、CD63/CD81和CD9/CD63的EV亞群分別為31.8%、31.1%和22.3%。除了共同表達(dá)兩種蛋白的EV群體的自然減少外，由于空間位阻，也可導(dǎo)致兩種蛋白的低效免疫熒光標(biāo)記陽性率降低。 四、結(jié)直腸癌細(xì)胞系中CD147陽性EV的分析 盡管使用EV作為癌癥診斷的生物標(biāo)志物的潛力一直很有前景，但臨床樣本中特異性EV亞型的定量仍然具有挑戰(zhàn)性。CD147是一種對乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)很重要的跨膜蛋白，在某些人類腫瘤類型中過表達(dá)。最近，從結(jié)直腸癌細(xì)胞系中分離的EV中證實(shí)了高水平的CD147表達(dá)，并使用光敏化珠檢測了從結(jié)直腸癌中分離的循環(huán)CD147/CD9雙陽性EV。在這里，我們應(yīng)用HSFCM分析了從結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT15和HCT116)和正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞系(CCD-18Co)中分離的EV上CD147的表達(dá)（圖4）。從不同細(xì)胞系分離的EV的CD147 PE熒光與SSC的雙變量點(diǎn)圖表明，CCD-18Co細(xì)胞分泌的只有不到10%的EV群體CD147陽性(圖4a)，而結(jié)直腸癌細(xì)胞系的則接近50%(圖4b，c)。來自癌細(xì)胞系的EV的CD147表達(dá)水平的升高表明了其在癌癥診斷中的潛在應(yīng)用價值。HSFCM提供了幾個比傳統(tǒng)的分析方法優(yōu)勢：Western blot分析顯示了樣品中相對的蛋白量(圖4d)，HSFCM還揭示了表達(dá)CD147的EV的百分比，并可以在單粒子水平上將蛋白質(zhì)豐度與囊泡大小相關(guān)聯(lián)。例如，CD147陽性的EV根據(jù)其細(xì)胞來源表現(xiàn)出不同的大小分布，例如，HCT15細(xì)胞的尺寸小，HCT116細(xì)胞的尺寸大（圖4）。 五、結(jié)直腸癌患者及健康供體血漿中CD147陽性EV的分析 結(jié)直腸癌的死亡率為40%?50%，早期診斷已給予適當(dāng)?shù)脑缙诟深A(yù)至關(guān)重要。由于CD147水平在正常和癌細(xì)胞系中存在差異(圖4d)，我們試圖確定CD147水平是否可以用于區(qū)分從結(jié)直腸癌患者（n=37）和健康人（n=32）血液樣本中分離的EV（表1）。分離過程如圖1b所示，僅需50μL的PFP就足以進(jìn)行HSFCM分析。我們首先使用羅丹明B異硫氰酸酯(RBITC)封裝的直徑80nm的熒光SiNPs測量血漿中的顆粒濃度（圖5a）。我們發(fā)現(xiàn)，癌癥患者和健康人的血漿濃度在不同個體間可相差40-50倍，而平均EV濃度沒有顯著差異（圖5b和表2）。然后，我們用PE偶聯(lián)抗體熒光染色分析CD147陽性EV的顆粒濃度。圖5c顯示了從患者樣本中分離出的EV的PE熒光與SSC的雙變量點(diǎn)圖，其中CD147陽性的EV為15.4%。使用已知顆粒濃度的100nm橙色熒光球來校準(zhǔn)樣品流速，測量CD147陽性EV的血漿濃度。29圖5d顯示，健康供體CD147陽性EV的平均濃度為（4.1±2.3）×10^7顆粒/mL，結(jié)直腸癌患者的平均濃度為（2.9±2.9）×10^8顆粒/mL，有差異顯著(P<0.001)。圖6所示的ROC曲線顯示，CD147陽性EV（來自結(jié)直腸癌患者和健康供體）的濃度顯示了一個優(yōu)秀的分類器，AUC為0.932。同時，在所有癌癥期患者中，甚至是I期患者中，均發(fā)現(xiàn)CD147陽性EV水平升高(圖5e)。這些結(jié)果表明，CD147陽性EV的顆粒濃度可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷。在術(shù)前和術(shù)后（術(shù)后第7天?10天）分析血液樣本時，16例結(jié)直腸癌患者中有13例在手術(shù)切除后CD147陽性EV的顆粒濃度顯著下降(P<0.05)(圖5f)。雖然還需要更多臨床樣本，以進(jìn)一步驗(yàn)證使用CD147陽性EV進(jìn)行結(jié)直腸癌診斷和治療監(jiān)測的可行性，這一結(jié)果表明，使用疾病特異性EV亞群的顆粒濃度在診斷和預(yù)后方面具有巨大的潛力。 文章就分享到這里，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~ 參考文獻(xiàn)： [1]Tian, Y; Ma, L; Gong, M; et al.Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry.[J].ACS Nano.2018,12(1):671-680 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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