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qwedfxcv新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
畢赤酵母KM71真核表達(dá)問(wèn)題 已有6人參與
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| 我用畢赤酵母KM71進(jìn)行表達(dá)抗菌肽，分子量為3kd-8kd之間，構(gòu)建載體沒(méi)有問(wèn)題，載體為pPIC9K，進(jìn)行篩選也可以篩選到，用載體上的引物與我片段的引物進(jìn)行驗(yàn)證也沒(méi)有問(wèn)題，將其電轉(zhuǎn)進(jìn)KM71中，進(jìn)行誘導(dǎo)96h，加甲醇的量為0.5%，誘導(dǎo)條件為250 rpm/30°，酵母生長(zhǎng)為2升BMGY,轉(zhuǎn)1/5到BMMY中，誘導(dǎo)96h結(jié)束后取上清發(fā)酵液進(jìn)行冷凍濃縮，之后進(jìn)行考染、Western檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)不到蛋白，我想請(qǐng)問(wèn)各位大佬，是否有那個(gè)重要的條件我沒(méi)有注意到，感覺(jué)蛋白根本誘導(dǎo)不出來(lái)。 |
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9樓2022-06-09 13:26:31
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2樓2022-01-14 18:30:43
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3樓2022-01-14 19:41:16
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 首先可以在電轉(zhuǎn)之后，篩選轉(zhuǎn)化成功的單克隆時(shí)，建議可以進(jìn)行一輪小量篩選（20*4 ml) ，小量WB鑒定成功后，再大量表達(dá)。也需要考慮你的感受態(tài)細(xì)胞是否正常，另一方面可以縮短誘導(dǎo)時(shí)間，蛋白分子量較小，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能存在長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)所致的蛋白降解，建議你也可以采取不同誘導(dǎo)時(shí)間的小量菌液，來(lái)進(jìn)行WB檢驗(yàn)。 |
4樓2022-01-14 21:05:06
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