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NanoFCMlxq新蟲 (正式寫手)
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[交流]
外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十三）（上） 已有2人參與
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今天分享一篇發(fā)表在 Trends in Biotechnology（2021年IF=19.536）上的文章，名為《Technologies and Standardization in Research on Extracellular Vesicles》[1]（細(xì)胞外囊泡的技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化研究）。 細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種磷脂雙層膜封閉結(jié)構(gòu)，包含RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物和其他分子，由各種細(xì)胞分泌到體液中。EV介導(dǎo)的生物分子轉(zhuǎn)移是各種生理和病理過程的重要組成部分。EV在新的診斷和治療策略中的潛在應(yīng)用已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。然而，由于EV固有的復(fù)雜的生物發(fā)生以及它們在大小、組成和起源上的巨大異質(zhì)性，其研究仍然具有很高的挑戰(zhàn)性。有必要建立標(biāo)準(zhǔn)化的方法來解決EV的異質(zhì)性和EV研究中分析前和分析多樣性的來源。在此，我們回顧了為EV分離和表征而開發(fā)的技術(shù)，并討論了EV研究的標(biāo)準(zhǔn)化路徑。 一、EV的生物發(fā)生、生物學(xué)意義和應(yīng)用 EV是一種磷脂雙層膜封閉的生物實(shí)體，存在于多種生理液體中。EV由各種類型的細(xì)胞分泌，攜帶來自其親本細(xì)胞的重要生物分子。EV的生成涉及多種生物發(fā)生途徑，根據(jù)這些途徑，EV可細(xì)分為幾種類型，包括外泌體和微囊泡(MVs)。外泌體(~30-150nm)是通過核內(nèi)體膜向多囊內(nèi)體(MVEs)成熟過程中向內(nèi)出芽產(chǎn)生的，而MVs(~100-1000nm)是由質(zhì)膜向外出芽形成的。然而，它們?nèi)匀挥袔讉�(gè)共同的特征，包括：脂質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集在核內(nèi)體/質(zhì)膜上；通過各種分選機(jī)制隔離胞質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)和其他生物分子，然后使小囊泡出芽和裂變；以及涉及對接、融合和攝取的細(xì)胞間運(yùn)輸。凋亡過程中形成的囊泡大于1000nm，稱為凋亡小體。最近創(chuàng)造的術(shù)語“外膜”描述了最小的(＜50nm)非膜結(jié)合納米顆粒和更大的大分子復(fù)合物，也可以包括在總的術(shù)語“EVs”下。 分選機(jī)制在涉及的細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物方面是多種多樣的，可以大致分為兩種主要途徑，依賴運(yùn)輸所需的核內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)和非依賴ESCRT。ESCRT依賴的機(jī)制是逐步發(fā)揮作用的，其中一系列ESCRT亞復(fù)合物(如TSG101、CHMP蛋白)參與其中。非依賴ESCRT的途徑涉及神經(jīng)酰胺依賴途徑，該途徑產(chǎn)生膜亞結(jié)構(gòu)域和四酯蛋白，如CD63、CD81和CD9，在膜上形成簇，誘導(dǎo)囊泡向內(nèi)出芽和EV的形成。此外，細(xì)胞質(zhì)蛋白，如熱休克70kDa蛋白(HSP70)，被歸于來自大多數(shù)細(xì)胞類型的外泌體中。核酸(DNA、mRNA和miRNA)是EV攜帶的另一種重要的分子。miRNA的分類是序列依賴的，導(dǎo)致特定miRNAs在EV中的差異分類�？偟膩碚f，EV的形成有多種途徑，導(dǎo)致異質(zhì)種群的釋放，可能在大小、組成和功能上存在很大差異。到目前為止，仍然很難根據(jù)分離的囊泡的亞群來確定一個(gè)特定的途徑。因此，顯然需要更好地理解區(qū)分EV的生物發(fā)生、分類和釋放的因素。 國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(ISEV)推薦使用“EV”作為這些類型的囊泡的總稱，因?yàn)楹茈y將EV分配給特定的生物發(fā)生途徑，除非通過實(shí)時(shí)成像技術(shù)在釋放過程中被捕獲。ISEV還建議根據(jù)EV的物理特征進(jìn)行分類，如大小和密度、不同的生化組成和表面電荷量。 一旦EV被釋放到細(xì)胞外空間，它們就會被受體細(xì)胞內(nèi)化（內(nèi)吞、吞噬或微胞吞作用），然后轉(zhuǎn)移EV的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，進(jìn)一步與靶細(xì)胞的細(xì)胞信號通路相互作用。EV用于在免疫細(xì)胞[樹突狀細(xì)胞(DCs)、B細(xì)胞、T細(xì)胞]之間傳遞信息，從而對免疫應(yīng)答產(chǎn)生免疫抑制或免疫激活作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞使用EV作為信號傳遞到其他神經(jīng)元細(xì)胞的主要途徑。更重要的是，EV已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病和阿爾茨海默病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的解剖連接區(qū)域之間的傳播中起作用。在心血管系統(tǒng)中，心臟成纖維細(xì)胞EV富含miR-21，這是心肌肥厚的重要旁分泌信號中介。此外，據(jù)報(bào)道，腫瘤來源的EV在癌癥的標(biāo)志中發(fā)揮作用，如腫瘤生長、侵襲性、避免凋亡、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、抵抗和轉(zhuǎn)移。 EV攜帶多種生物物質(zhì)，被認(rèn)為反映了親本細(xì)胞的生理狀態(tài)。EV的成分已經(jīng)在病理生理狀態(tài)的探測中被研究作為疾病診斷和監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。例如，來自結(jié)直腸癌(CRC)患者血液樣本的上皮來源EV的miRNA分析顯示，與健康個(gè)體相比，13個(gè)EpCAM+-EVmiRNA水平升高。此外，I期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的EV miRNA圖譜能夠區(qū)分癌癥的不同階段。在蛋白質(zhì)方面，我們發(fā)現(xiàn)CD147在CRC細(xì)胞系分泌的EV以及CRC患者的血清中富集。癌癥患者中CD9和CD147均呈陽性的EV水平顯著高于健康供體。盡管這些研究突出了EV的診斷潛力，但EV分離和鑒定方面的挑戰(zhàn)直接影響了EV生物標(biāo)志物的特異性和敏感性，以及它們轉(zhuǎn)化為強(qiáng)大診斷工具的能力。 EV已被用于運(yùn)輸多種治療分子，如siRNA、miRNA和小分子。各種方法，如轉(zhuǎn)染、孵育、超聲處理、循環(huán)凍融和電穿孔處理，已經(jīng)被開發(fā)出來用于裝載這些分子。裝載方法的選擇取決于裝載分子的類型；例如，對于小的非編碼RNA(siRNA和miRNA)，分離前轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞和分離后電穿孔是目前首選的方法。小分子抗癌藥物如阿霉素和紫杉醇可通過孵育被納入EV，并在臨床前研究中顯示了增強(qiáng)的抗腫瘤活性。與其他傳遞載體相比，工程EV提供的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢是能夠整合配體，它可以特異性地靶向癌細(xì)胞并逃避免疫反應(yīng)。Kalluri實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)表明，裝載siRNA的CD47+EVs僅靶向KRAS突變的腫瘤，與攜帶類似數(shù)量的的脂質(zhì)體相比，顯示出更高的治療效果。來自Amiji實(shí)驗(yàn)室的研究者使用了一種新的方法來調(diào)節(jié)來自癌細(xì)胞的EV miRNA含量，將巨噬細(xì)胞從M2（原腫瘤）重新編程為M1（抗腫瘤）。此外，EV免疫信號已被用于產(chǎn)生抗腫瘤作用。最近的一項(xiàng)研究調(diào)查了DC衍生的EV與或不與程序性細(xì)胞死亡-1(PD-1)抗體一起使用索拉非尼治療肝細(xì)胞癌的潛在協(xié)同效應(yīng)�；贓V作為藥物傳遞工具和免疫療法的潛力，一些公司，如Capricor Therapeutics、Codiak Biosciences、Evox Therapeutics和Puretech Health，已經(jīng)開始了產(chǎn)品開發(fā)工作，將EV療法轉(zhuǎn)化為臨床。在https://ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上搜索關(guān)鍵詞“外泌體”或“細(xì)胞外囊泡”，可以發(fā)現(xiàn)一些臨床試驗(yàn)，這些試驗(yàn)正在招募各種類型疾病的患者，包括幾種類型的癌癥、神經(jīng)退行性疾病、焦慮、糖尿病和covid-19。由于親本細(xì)胞抗原的表面表達(dá)，DC衍生的外泌體已被用于疫苗傳遞，并在不同類型癌癥的多個(gè)I期試驗(yàn)中被證明是安全的。在II期臨床研究中顯示了一些有希望的結(jié)果，使用這些負(fù)載腫瘤抗原的EV作為抗NSCLC聯(lián)合環(huán)磷酰胺的疫苗。盡管EV的治療應(yīng)用取得了這些有趣的進(jìn)展，但在將EV治療轉(zhuǎn)化為臨床方面仍存在一些挑戰(zhàn)。其中一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是親本細(xì)胞通過各種復(fù)雜的生物發(fā)生途徑產(chǎn)生EV固有成分的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性可導(dǎo)致EV大規(guī)模生產(chǎn)的批次內(nèi)和批間差異。為了將EV成功轉(zhuǎn)化到臨床，識別影響產(chǎn)品效力和穩(wěn)定性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)（如大小、純度、分子組成）是必不可少的。 這篇綜述全面概述了EV分離和鑒定的傳統(tǒng)和新興的方法，以及這些方法所面臨的主要挑戰(zhàn)。此外，還強(qiáng)調(diào)了實(shí)現(xiàn)所討論方法的標(biāo)準(zhǔn)化的可能途徑，并確定了這些技術(shù)在推廣和標(biāo)準(zhǔn)化方面的潛在好處和缺點(diǎn)。這對已發(fā)表報(bào)告和對這些方法優(yōu)缺點(diǎn)的嚴(yán)格評估將幫助讀者了解當(dāng)前EV研究和確定最有效的路徑選擇，在未來的相關(guān)研究領(lǐng)域的研究中實(shí)現(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)化感興趣的特定技術(shù)。 二、EV分離：挑戰(zhàn)和需求 1.EV的來源：EV的異質(zhì)性和復(fù)雜性 EV可從各種生理液體中分離出來。血液是EV最豐富的來源之一，估計(jì)濃度為5-15×10^8顆粒/ml。從血液中分離EV的一個(gè)挑戰(zhàn)是它含有脂蛋白[＜35nm，密度1.06-1.20g/cm3，極低、低、高密度脂蛋白(VLDL、LDL、HDL)]和乳糜微粒[75-1100nm，密度＜0.930g/cm3；a.k.a.超低密度脂蛋白(ULDLs)，它在大小和密度上與EV重疊，不能通過傳統(tǒng)的方法分離(例如，超離心(UC)]。其他影響血液中EV的數(shù)量、純度和異質(zhì)性的因素包括樣本采集、處理、儲存條件、穩(wěn)定性、抗凝劑、采血量、采血時(shí)間、動物/患者的年齡、性別、疾病狀態(tài)和喂養(yǎng)/禁食狀態(tài)。在晚期卵巢癌的病例中，會出現(xiàn)出血性惡性腹水，其中包含各種細(xì)胞類型分泌的大量EV，以及細(xì)胞、胞質(zhì)成分和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)片段。這些額外的成分不僅影響EV亞群體的化學(xué)成分，而且還改變了其物理性質(zhì)，如血液的粘度，增加了分離高純度EV群體的難度。進(jìn)一步的異質(zhì)性來自于從細(xì)胞中釋放出來的各種囊泡的生物發(fā)生。 2.規(guī)�；屯� 大多數(shù)用于EV分離的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室級別的方法都采用了多個(gè)分離步驟，這給大規(guī)模生產(chǎn)帶來了挑戰(zhàn)，而且通量很低。近年來，切向流過濾(TFF)結(jié)合基于色譜的方法已被開發(fā)出來，用于大規(guī)模的基于cGMP的EV生產(chǎn)。這一額外的分離步驟能夠更有效地去除蛋白質(zhì)污染物，并能產(chǎn)生與UC類似的EV產(chǎn)量。同樣，基于尺寸排阻的EV分離方案也可以很容易地?cái)U(kuò)大規(guī)模。 3.關(guān)于樣品收集、處理和儲存的標(biāo)準(zhǔn)化的建議 鑒于生物流體的復(fù)雜性和異質(zhì)性，通過樣品收集、存儲和處理的標(biāo)準(zhǔn)化，盡量減少預(yù)分離和分析前變量至關(guān)重要。這里列出了一些減少下游分離和分析的人為因素影響的建議和措施。 4.樣本收集、樣本匹配、樣本量和數(shù)據(jù)收集 對于從培養(yǎng)細(xì)胞中分離EV，建議如果可能，使用無血清培養(yǎng)基，或無EV血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長補(bǔ)充劑。臨床血液樣本采集，重要的是使用最小化剪切力的針頭，減少血小板活化和血小板和紅細(xì)胞衍生EV的釋放，丟棄第一段收集的血液，靜脈穿刺引起的細(xì)胞碎片也會造成污染。對于每個(gè)被收集到的標(biāo)本，親本細(xì)胞也建議盡可能進(jìn)行收集，以實(shí)現(xiàn)分子匹配、圖譜分析、細(xì)胞和EV成分的差異分析，并確定與EV源變化相關(guān)的特定分子特征，如疾病的階段。進(jìn)食/禁食狀態(tài)和樣本采集時(shí)間（晨/晚）影響樣本中的EV水平，但需要更多的研究來確定最佳參數(shù)。當(dāng)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物和分析EV成分的實(shí)驗(yàn)時(shí)，具有至少80%的統(tǒng)計(jì)功效的樣本量至關(guān)重要。最后，應(yīng)收集有關(guān)患者/動物的年齡、性別、種族、疾病狀態(tài)和治療狀態(tài)的信息，以了解這些參數(shù)對EV含量分析的影響。 5.樣本處理 大多數(shù)已發(fā)表的從血液中分離EV的研究建議使用血漿進(jìn)行分離，因?yàn)檠逯泻醒“鍋碓吹腅V，這些血小板主要在凝血過程中釋放。此外，抗凝血?jiǎng)?肝素、檸檬酸、EDTA)的選擇也會影響研究結(jié)果。許多研究表明，使用EDTA作為下游EV-RNA分析的抗凝劑，因?yàn)樗梢宰柚笶V-細(xì)胞聚集物的形成，抑制血小板來源的釋放，并且肝素會抑制PCR反應(yīng)。通過初步離心分離細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞(WBCs)、血小板），應(yīng)以盡量減少細(xì)胞成分釋放的速度進(jìn)行。此外，必須采取預(yù)防措施，盡量減少加工時(shí)間，以避免樣品由于溫度和酶活性如RNA酶和蛋白酶水解而導(dǎo)致降解。 6.樣品穩(wěn)定性和儲存 許多研究已經(jīng)進(jìn)行了各種生物液體，如尿液、血液和支氣管肺泡灌洗(BAL)評估各種存儲溫度的影響(4°C?20°C和?80°C)和凍融循環(huán)（一到十）的大小，組成，和功能�？偟膩碚f，目前的證據(jù)表明，?80°C是保存EV含量用于下游分子譜分析的最佳溫度。然而，應(yīng)盡量減少凍融循環(huán)，因?yàn)镋V可能會發(fā)生聚集和裂解，導(dǎo)致高估EV大小，低估EV計(jì)數(shù)，并在分離過程中造成損失。此外，當(dāng)擬用于藥物傳遞應(yīng)用的EV經(jīng)過凍融循環(huán)時(shí)，載物的損失會導(dǎo)致效力的喪失。 三、EV分離方法 需要高效分離EV或EV亞群，并從污染蛋白和其他可能的基質(zhì)污染物中分離出來，以確保準(zhǔn)確推斷EV或感興趣的特定EV亞群的生物活性和功能。在這里，我們描述了目前和常用的EV分離方法及其優(yōu)缺點(diǎn)（總結(jié)見表1）。 1.UC 目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)是UC，它根據(jù)EV的密度從其他樣品成分中分離和濃縮出來。EV的密度通常為1.13-1.19g/ml。這個(gè)過程先將所有細(xì)胞和細(xì)胞碎片分離出來，然后上清液轉(zhuǎn)移到超離心機(jī)離心兩次100 000xg或更高的速度，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗重懸，減少蛋白質(zhì)污染。然而，這種方法也可以分離出不同大小和組成的MV和微粒，包括病毒、脂蛋白顆粒和蛋白質(zhì)復(fù)合物。UC的通量也很低，需要昂貴的專業(yè)設(shè)備，過程中也會破壞EV膜或引起聚集。使用額外的密度梯度步驟，可以進(jìn)一步提高基于UC的EV分離的純度。蔗糖梯度和商業(yè)化OptiPrep密度梯度是常用的方法。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，可能需要額外的純化步驟來將EV亞群彼此分離、從其他密度相似的微粒和密度梯度基質(zhì)中分離出來。 2.SEC 尺寸排除色譜(SEC)根據(jù)水動力體積分離樣品的組分。SEC通常使用瓊脂糖CL-2B或類似的平穩(wěn)基相柱進(jìn)行，其中組分用PBS洗脫。SEC簡單穩(wěn)定、可規(guī)模化，不需要昂貴的設(shè)備，并且可以在溫和的洗脫條件下使用，應(yīng)用廣泛。此外，SEC可能是一種有效的下游蛋白質(zhì)組學(xué)分析的EV分離方法，因?yàn)楦哓S度蛋白還原與UC相當(dāng)或更好。然而，它受到EV分離的低分辨率和稀釋度的限制。有充分的證據(jù)表明，在SEC囊泡分離物中存在污染物，包括脂蛋白顆粒、病毒顆粒、游離蛋白質(zhì)和來自生物基質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。然而，基于SEC的分離方法的產(chǎn)量和EV：蛋白比值通常都顯著高于基于UC的方法。然而，同樣的研究表明，UC分離比SEC分離產(chǎn)出更多較小EV，并含有更少的載脂蛋白(APO)顆粒。此外，SEC固定相可能與分析物表現(xiàn)出非特異性的相互作用（即離子交換相互作用），從而導(dǎo)致分離選擇性的變化。 3.過濾法 過濾使用由分子質(zhì)量和大小定義范圍的基質(zhì)，通常使用纖維素過濾器。在初始過濾后，通常包括額外的超濾和洗滌步驟，以去除小于特定尺寸的污染物，并濃縮囊泡樣品�；陔x心的過濾器(Centricon)已被證明可以回收的顆粒是壓力驅(qū)動膜(BioMax)的三倍。聚熱砜納米膜也已成功應(yīng)用。一個(gè)更優(yōu)化版本-TFF，比傳統(tǒng)的過濾更不容易堵塞。與UC相比，過濾技術(shù)具有壓力溫和、省時(shí)、純化效果好和可規(guī)�；葍�(yōu)點(diǎn)。此外，分離在很大程度上取決于濾膜的質(zhì)量和膜孔徑分布的均勻性。此外，過濾可能會由于擠壓效應(yīng)而改變EV的結(jié)構(gòu)完整性，并導(dǎo)致EV在過濾膜上損失。因此，該方法對高復(fù)雜性和高動態(tài)范圍的生理液體的適用性可能會受到低回收率和從高豐度污染物中分離效率不足的限制。 4.基于免疫親和性的分離策略 基于免疫親和的分離策略使用高度特異性的抗體-抗原相互作用來靶向特定的EV群體，減少受污染的EV和微粒。在許多研究中，已經(jīng)使用抗體分離出了EV。其中一種方法是，生物素化抗體在鏈霉親和素包被的磁珠上捕獲，以分離特定的EV亞群。另一種方法使用基于紙的免疫親和裝置，通過將抗體偶聯(lián)到色譜紙上，然后使用掃描電子顯微鏡(SEM)或ELISA，針對已知的特定疾病標(biāo)記物以及肝素的抗體已被用于純化EV并評估其診斷潛力。免疫親和分離減少了分離時(shí)間，增加了純化的特異性，但成本昂貴，且經(jīng)常受到非特異性結(jié)合、競爭性抑制和抗體的交叉反應(yīng)性的困擾。此外，抗體的壽命較短，而且EV從固定階段的特異性釋放可能是不確定的。 5.商業(yè)化試劑 最近，已經(jīng)出現(xiàn)一些商業(yè)化試劑盒來分離EV，其產(chǎn)量可與基于UC的技術(shù)相當(dāng)，而不需要任何專用設(shè)備。目前已有基于聚合物沉淀的商業(yè)EV分離試劑盒，包括ExoQuick?外泌體沉淀溶液（(Systems Bioscience）、miRCURY(Exiqon)和總外泌體分離試劑(TEIR)（Invitrogen）。像PureExo和MagCapture這樣的非沉淀試劑盒也是有市售的。另一種試劑盒是Exo-Flow，它使用抗體標(biāo)記的磁珠來靶向表面蛋白。總的來說，這種試劑盒通常也會導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)污染，需要長時(shí)間的分離過程，而且可能會很昂貴。此外，這種試劑盒的專有配方可能會干擾下游實(shí)驗(yàn)。Exocuick、miRCURY、TEIR和UC的比較研究顯示，分離的EV大小分布相似。 6.新興技術(shù) 由于EV的研究是一個(gè)相當(dāng)新的領(lǐng)域，新的EV分離技術(shù)正在不斷發(fā)展。在這里，我們將討論最近出現(xiàn)的幾種方法。 （1）微流體 微流控EV分離技術(shù)包括免疫親和捕獲和基于EV的物理或力學(xué)特性（尺寸、密度、可壓縮性、粘彈性等）的捕獲�；谖锢硇再|(zhì)的方法要么是壓力驅(qū)動的，要么是電泳驅(qū)動的，后者不太容易堵塞孔隙或通道。ExoChip捕獲具有抗cd63抗體功能化的聚二甲基硅氧烷表面修飾的EV，然后進(jìn)行熒光碳氰酸染料染色，以快速定量EV。另一種微流控過濾裝置利用多孔聚合物單體作為過濾膜，調(diào)整到不同的幾何形狀和孔徑。粘彈性流和聲分離系統(tǒng)也是新型無損無標(biāo)記微流控技術(shù)，可能用于EV分離和尺寸分類。這些方法具有樣品量低、成本低、消耗量低、高通量、精度高等優(yōu)點(diǎn)。 （2）不對稱流場流分餾法（AF4） AF4是一種溫和的分離技術(shù)，不需要可能改變、保留和降解EV樣品的固定相。分離是在層流的薄膜（亞毫米）中完成的，層流被限制在一個(gè)底部有膜的狹窄室中，其中施加一個(gè)垂直于層流的力場。與基于色譜的分離方法不同，AF4具有可編程的交叉流強(qiáng)度，可以在分離過程中進(jìn)行優(yōu)化，以提高效率。最近的研究表明，AF4結(jié)合敏感的分子分析，可以作為一種有效的分離技術(shù)，基于特定的EV和顆粒亞群的大小，從而解決生理液體中EV異質(zhì)性的復(fù)雜性。在線探測器，包括紫外、多角度光散射(MALS)和動態(tài)光散射(DLS)，被有效地用于AF4，將小EV分離成不同的亞群——小外泌體(Exo-S，60-80nm)、大外泌體(Exo-L，90-120nm)和更小外泌體(~35nm)。 （3）納米流式檢測技術(shù)（Nano-FCM） 通過對背景參考噪聲的系統(tǒng)分析，開發(fā)了一種基于高分辨流式(FCM)的EV分類方法。采用該方法，對來自免疫細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯和細(xì)胞微量紫染色EV進(jìn)行了分類，保真度分別為78%和99%，[100]。EV FCM的缺點(diǎn)包括可能同時(shí)檢測到兩個(gè)或多個(gè)EV，或集群檢測，導(dǎo)致信號高估和不適當(dāng)?shù)臏y量，特別是在處理亞微米大小的粒子時(shí)（這里指的并不是NanoFCM納米流式，而是Sony的細(xì)胞流式）。也有可能引入脂蛋白顆粒污染，以及使用不適當(dāng)?shù)某叽鐦?biāo)準(zhǔn)。 （4）多種技術(shù)結(jié)合 為了提高EV分離的特異性或純度，可以結(jié)合多種方法。UC之后的密度梯度步驟，SEC或AF4，已經(jīng)有報(bào)道。另一種組合方法是超濾后液相色譜(LC)，已被證明回收率明顯高于UC，并能保持其生物物理特性。 四、EV的鑒定：挑戰(zhàn)和需求 LDLs的直徑與外泌體相似，而HDLs在所有EV的密度范圍內(nèi)都有存在。當(dāng)使用傳統(tǒng)的方案時(shí)，EV分離物極有可能含有脂蛋白。消除污染蛋白將通過減少可能的污染物提高表征結(jié)果，然而，使情況更具挑戰(zhàn)性的是，EV的回收率和蛋白質(zhì)產(chǎn)量可能較低，并在分離和樣品處理的后續(xù)步驟中進(jìn)一步損失。此外，雖然有一些常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記，但為所有可能的EV類型尋找一個(gè)通用的標(biāo)記Panel或針對特定EV群體的特定標(biāo)記Panel仍然是該領(lǐng)域的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。設(shè)計(jì)簡單、有效和經(jīng)濟(jì)有效的方法來評估EV分離的純度，將使生物和臨床應(yīng)用成為可能，并將促進(jìn)EV領(lǐng)域急需的標(biāo)準(zhǔn)化。 五、EV表征方法 1.理化表征方法 在表2和圖3中總結(jié)了這些方法。 （1）顯微鏡和成像 利用共聚焦顯微鏡，EV的釋放、攝取和交換可以通過~200nm分辨率的熒光標(biāo)記細(xì)胞膜來監(jiān)測。另一種方法是將用報(bào)告基因標(biāo)記的EV注射到活標(biāo)本中，并通過各種方法進(jìn)行成像，包括MRI、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描/正電子發(fā)射斷層掃描(spect/PET)或熒光介導(dǎo)斷層掃描(FMT)。這些成像方法可以用來確定哪些組織和器官的EV被吸收，并可以監(jiān)測宿主對EV的降解情況。 使用這些方法監(jiān)測EV的優(yōu)點(diǎn)是：可以確定它們在宿主體內(nèi)的位置；EV被細(xì)胞產(chǎn)生和吸收時(shí)可以觀察到；可以在動物研究中獲得圖像，而不使用侵入性采樣技術(shù)。然而，它也有一些缺點(diǎn)。一種用于標(biāo)記EV的常見染料(PKH67)可以比EV更持久或聚集，形成膠束，從而導(dǎo)致假陽性，導(dǎo)致EV總數(shù)被高估。其他挑戰(zhàn)包括需要高度特異性和穩(wěn)定性的標(biāo)簽，并通過熒光獲得可靠的EV濃度。 透射電子顯微鏡(TEM)是一種用于識別樣品中的粒子的成像方法。EV被固定在樣品網(wǎng)格上，并在分析前用醋酸鈾�；蛩难趸~等試劑進(jìn)行染色。電子輻射將分辨率提高到亞納米的分辨率。2D和3D圖像都可以使用各種計(jì)算機(jī)程序來創(chuàng)建。TEM和冷凍透射電鏡（低溫條件）也可以用于觀察通過細(xì)胞出芽的EV的形成，可以比較不同細(xì)胞類型或條件之間的EV形成。 冷凍透射電鏡的優(yōu)點(diǎn)包括能夠直接觀察樣品，將損傷降低6倍，在樣品制備過程中盡量減少脫水導(dǎo)致的形態(tài)變化，并且不需要染色程序。然而，使用TEM/冷凍TEM的缺點(diǎn)包括對將圖像轉(zhuǎn)換為3D的計(jì)算能力需求高，挑戰(zhàn)樣品制備和處理方法，由于冰偽影(cryo-TEM)導(dǎo)致的低信噪比，高成本和低通量。同時(shí)也很難判斷EV是進(jìn)入細(xì)胞還是從細(xì)胞出芽（內(nèi)吞作用和胞吐作用）。由于制備技術(shù)，一些較大的EV可能被排除在外。此外，TEM也不是可靠的定量技術(shù)。因此，如果需要進(jìn)行濃縮，還應(yīng)該使用其他技術(shù)。最近，可以自動分析TEM圖像的軟件(TEM ExosomeAnalyzer)被創(chuàng)建出來，但目前還不能使用冷凍透射電鏡圖像。這樣的軟件工具將減少人類主觀判斷所帶來的誤差。 除了透射電鏡外，原子力顯微鏡(AFM)也是一種高分辨率的EV成像技術(shù)。在一項(xiàng)研究中，AFM被用來表征血小板衍生的EV，這些EV被捕獲在CD41抗體修飾的云母表面上。結(jié)果顯示，CD41陽性EV的數(shù)量和尺寸分布結(jié)果可重復(fù)；更高的分辨率使AFM能夠檢測到小到幾nm的EV，這遠(yuǎn)比常規(guī)的FCM更靈敏。除了提供EV的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)外，AFM還能夠提供子結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。在一項(xiàng)研究中，在 phase-modulated tapping模式下，成像力從b1 nN到~2 nN，圓形EV在特定階段在中心凹陷處出現(xiàn)變形。這表明EV的密度和成分不均勻，這與之前在不同EV裝載物中的發(fā)現(xiàn)一致。與透射電鏡一樣，有限的通量和專業(yè)設(shè)備要求是AFM的缺點(diǎn)。 （2）DLS DLS，也被稱為光子相關(guān)光譜或準(zhǔn)彈性光散射，是一種確定懸浮在流體介質(zhì)中的粒子大小分布的技術(shù)。DLS主要測量溶液中大分子結(jié)構(gòu)與溶劑分子碰撞引起的布朗運(yùn)動速度。通過DLS測量尺寸提供了一種簡單而節(jié)省時(shí)間的技術(shù)，它提供了關(guān)于粒度大小分布的平均尺寸和分散性的信息，從1nm到6μm的粒子的多分散性指數(shù)(PDI)。DLS已被用于一些涉及從血液和BAL等生物液體中分離的EV特性的研究。DLS是單分散樣品尺寸測量和監(jiān)測聚集的理想方法，因?yàn)樯⑸鋸?qiáng)度與d^6成正比，其中d是粒子的直徑。在生物流體中，由于存在不同大小的囊泡、顆粒和生物分子，樣品是多分散的，其范圍從幾納米到幾千納米不等。必須去除大顆粒(＞1μm)，如細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞，以及聚集的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物。低分辨率是DLS的一個(gè)重要限制，只有當(dāng)粒子的大小差別至少3倍以上（例如，50nm和150nm）的峰值分辨率才是最好的，導(dǎo)致當(dāng)粒子有一個(gè)接近的粒徑分布時(shí)的結(jié)果展寬嚴(yán)重，PDI值更大。 （3）納米顆粒跟蹤分析(NTA) NTA是一種暗場顯微鏡技術(shù)，基于激光散射跟蹤的粒子的布朗運(yùn)動，可以有效地測量液體懸浮液中的顆粒粒徑分布和濃度。粒子在激光照明下散射光，它們的布朗運(yùn)動由配備攝像機(jī)的光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)成像。通過跟蹤單個(gè)粒子的均方位移，該軟件可以使用斯托克斯-愛因斯坦方程來確定其理論水動力直徑。與DLS中光散射和粒徑分布偏向于大粒子的情況相比，NTA通過測量光散射強(qiáng)度和單個(gè)粒子的大小，為大小不同的非均勻粒子混合物提供了更好的分辨率。此外，NTA可檢測用穩(wěn)定熒光團(tuán)標(biāo)記的EV。被分析物的折射率(RI)（例如，膠體金的高RI和細(xì)胞來源的囊泡的低RI）決定了NTA可檢測到的大小范圍。最小的可檢測的EV尺寸通常在50nm左右，但信噪比和散射光的量也應(yīng)該被考慮在內(nèi)，以提高測量的精度。由于布朗運(yùn)動很難精確跟蹤，其上限約為1μm，EV定量分析的準(zhǔn)確性也是一個(gè)挑戰(zhàn)。 （4）FCM FCM可以用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，或通過測量光散射或樣品顆粒的熒光來確定EV的大小。樣品可以用熒光標(biāo)記和/或抗體(抗cd63、抗cd81或抗cd9)進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤EV。樣品通過不同波長的多個(gè)激光器，即散射光，前向散射(FSC)或熒光的數(shù)量和方向，以及持續(xù)時(shí)間，表示測量的EV的大小，而側(cè)向散射(SSC)表示內(nèi)部復(fù)雜性。SSC比FSC更敏感，更適合用于低濃度樣品的分析。也有報(bào)道稱，使用較低的波長(405nm)提高了所有EV尺寸的SSC靈敏度和分辨率，對較小的EV有更顯著的影響。為了提高EV的檢測水平，可以將親脂性熒光團(tuán)或EV特異性熒光標(biāo)記抗體結(jié)合到EV膜上。對特定靶蛋白的定性和定量分析可以幫助確定哪個(gè)EV亞群更普遍，這可能對各種疾病的診斷至關(guān)重要。 FCM的優(yōu)點(diǎn)包括適用于未經(jīng)處理的生物樣品、分析速度快、可重復(fù)和定量。然而，大多數(shù)流式細(xì)胞儀上檢測不到200nm以下的粒子。為了降低檢測限，納米流式檢測儀（NanoFCM）被開發(fā)出來。同樣的原理也適用；然而，收集到的光散射的角度也發(fā)生了變化，允許探測到40nm的顆粒。如前所述，集群效應(yīng)也會影響測量值。不幸的是，由于RIs的差異，光散射標(biāo)準(zhǔn)球并不能正確地與EV尺寸相關(guān)。由于EV的RI低于聚合物標(biāo)準(zhǔn)球，因此EV的測量尺寸可能是相應(yīng)尺寸標(biāo)準(zhǔn)的兩倍左右。硅球的RI比聚苯乙烯球更類似于EV，因此它們可以作為更好的標(biāo)準(zhǔn)。二氧化硅和聚苯乙烯的標(biāo)準(zhǔn)替代品也被引入用于EV FCM分析。例如，脂質(zhì)體或中空的有機(jī)硅珠散射光類似于EV。此外，來自不同制造商的硬件差異可能會導(dǎo)致差異，在比較來自不同流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該考慮到這一點(diǎn)。（NanoFCM使用二氧化硅球作為標(biāo)準(zhǔn)品，比普通流式用PS球更接近生物樣本的折射率。） （5）電阻脈沖傳感器(RPS) RPS是一種基于庫爾特效應(yīng)測量溶液中粒子的大小、濃度和電荷的高通量方法。當(dāng)粒子通過兩側(cè)有電解質(zhì)溶液的膜中亞微米大小的孔時(shí)，測量施加電流的變化。粒子的大小由電流與背景電流的變化之比決定的。干擾的長度與粒子的體積有關(guān)，電阻率與濃度有關(guān)。通過將電阻顆粒信號與電壓和壓力聯(lián)系起來，可以測量zeta電位。在Spectradyne LLC的儀器中，樣品通過一個(gè)固體孔或孔徑，而Izon Science的儀器有一個(gè)可調(diào)的、可拉伸的孔，可以為特定的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。 RPS是一種很有吸引力的EV表征方法，因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)測量低至40nm顆粒的尺寸、濃度和zeta電位。該技術(shù)也可以調(diào)整到一個(gè)特定的尺寸范圍，需要大約40μl的樣品。然而，與NTA類似，RPS不能確定樣品的顆粒類型或化學(xué)組成，這使得很難確定樣品是否含有EV、蛋白質(zhì)聚集物或其他非膜性顆粒（如脂蛋白、碎片）。另一個(gè)問題是，RPS和NTA在檢測較大(＞150nm)和較小(＜150nm)的EV時(shí)，檢測結(jié)果不一致：RPS可能傾向于更有效地檢測較大的粒子，而NTA可能傾向于較小的粒子。挑戰(zhàn)在于確定哪種方法更準(zhǔn)確，或者這兩種方法是否可以串聯(lián)使用，以獲得樣品中EV的更準(zhǔn)確的表征。聚苯乙烯或二氧化硅球，以及潛在的其他標(biāo)準(zhǔn)，被用來校準(zhǔn)RPS儀器，這為初始標(biāo)準(zhǔn)化提供了依據(jù)。具有不同表面化學(xué)性質(zhì)或脂質(zhì)體的珠子被用來校準(zhǔn)zeta電位。這種技術(shù)需要頻繁的校準(zhǔn)。在許多研究中，該儀器在每個(gè)樣品之前進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保EV樣品的正確測量。 （6）新興技術(shù) 拉曼光譜(RS)是基于非彈性光散射，其中光子能量轉(zhuǎn)移到EV分子或從EV分子轉(zhuǎn)移出來，導(dǎo)致波長從入射光的波長偏移。轉(zhuǎn)移能量的量與散射光子波長的位移成正比，這取決于樣品粒子的分子排列。對非彈性散射光子的測量得到了一個(gè)光譜指紋，在外觀上類似于紅外光譜。RS以前已被用于來自哺乳動物細(xì)胞系、細(xì)菌和人類樣本的EV。 該方法通常能夠在一次測量中提供關(guān)于樣品的化學(xué)成分或至少是樣品的主要成分的一些信息，最少只需要準(zhǔn)備50μl樣品。雖然RS似乎可識別EV，但由于EV的化學(xué)復(fù)雜性，獲取信息光譜具有挑戰(zhàn)性。RS的通量一般，這使得在臨床上使用具有挑戰(zhàn)性。RS可以用于相對快速的EV測量，而不需要靶向蛋白生物標(biāo)志物。RS已在工業(yè)上用于小分子；然而，也有研究表明，RS也可以用于EV分析。RS被證明有可能識別特定囊泡的來源（如骨髓、脂肪組織、真皮成纖維細(xì)胞）的潛力。本研究開發(fā)的方法表明，在EV被用于體內(nèi)或體外臨床應(yīng)用之前，可以進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的批量鑒定。這種方法可用于增加生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供的EV產(chǎn)品的數(shù)量。 頻率鎖定光學(xué)低語倏逝共振（FLOWER）使用一種防腐涂層硅微環(huán)管，其共振頻率被激光探測。樣品流過微環(huán)狀光學(xué)諧振器，EV與抗體結(jié)合。每次分析物結(jié)合，共振頻率移動和EV濃度計(jì)數(shù)都可獲得。振幅的變化對應(yīng)于與微環(huán)面結(jié)合或脫離結(jié)合的粒子的直徑。這種方法仍然需要進(jìn)一步的評估，但它有識別EV的潛力。 單粒子干涉反射成像(SP-IRI)，作為ExoView系統(tǒng)出售，是基于固定在傳感器表面的粒子（用熒光抗體標(biāo)記）與從傳感器表面反射的光的干擾。干擾可以與大小相關(guān)。這項(xiàng)技術(shù)主要應(yīng)用于病毒，但也開始應(yīng)用于EV。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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