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NanoFCMlxq新蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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外泌體相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（十三）（上） 已有2人參與
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今天分享一篇發(fā)表在 Trends in Biotechnology（2021年IF=19.536）上的文章，名為《Technologies and Standardization in Research on Extracellular Vesicles》[1]（細(xì)胞外囊泡的技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化研究）。 細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種磷脂雙層膜封閉結(jié)構(gòu)，包含RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物和其他分子，由各種細(xì)胞分泌到體液中。EV介導(dǎo)的生物分子轉(zhuǎn)移是各種生理和病理過(guò)程的重要組成部分。EV在新的診斷和治療策略中的潛在應(yīng)用已經(jīng)引起了越來(lái)越多的關(guān)注。然而，由于EV固有的復(fù)雜的生物發(fā)生以及它們?cè)诖笮�、組成和起源上的巨大異質(zhì)性，其研究仍然具有很高的挑戰(zhàn)性。有必要建立標(biāo)準(zhǔn)化的方法來(lái)解決EV的異質(zhì)性和EV研究中分析前和分析多樣性的來(lái)源。在此，我們回顧了為EV分離和表征而開(kāi)發(fā)的技術(shù)，并討論了EV研究的標(biāo)準(zhǔn)化路徑。 一、EV的生物發(fā)生、生物學(xué)意義和應(yīng)用 EV是一種磷脂雙層膜封閉的生物實(shí)體，存在于多種生理液體中。EV由各種類(lèi)型的細(xì)胞分泌，攜帶來(lái)自其親本細(xì)胞的重要生物分子。EV的生成涉及多種生物發(fā)生途徑，根據(jù)這些途徑，EV可細(xì)分為幾種類(lèi)型，包括外泌體和微囊泡(MVs)。外泌體(~30-150nm)是通過(guò)核內(nèi)體膜向多囊內(nèi)體(MVEs)成熟過(guò)程中向內(nèi)出芽產(chǎn)生的，而MVs(~100-1000nm)是由質(zhì)膜向外出芽形成的。然而，它們?nèi)匀挥袔讉�(gè)共同的特征，包括：脂質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集在核內(nèi)體/質(zhì)膜上；通過(guò)各種分選機(jī)制隔離胞質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)和其他生物分子，然后使小囊泡出芽和裂變；以及涉及對(duì)接、融合和攝取的細(xì)胞間運(yùn)輸。凋亡過(guò)程中形成的囊泡大于1000nm，稱(chēng)為凋亡小體。最近創(chuàng)造的術(shù)語(yǔ)“外膜”描述了最小的(＜50nm)非膜結(jié)合納米顆粒和更大的大分子復(fù)合物，也可以包括在總的術(shù)語(yǔ)“EVs”下。 分選機(jī)制在涉及的細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物方面是多種多樣的，可以大致分為兩種主要途徑，依賴(lài)運(yùn)輸所需的核內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)和非依賴(lài)ESCRT。ESCRT依賴(lài)的機(jī)制是逐步發(fā)揮作用的，其中一系列ESCRT亞復(fù)合物(如TSG101、CHMP蛋白)參與其中。非依賴(lài)ESCRT的途徑涉及神經(jīng)酰胺依賴(lài)途徑，該途徑產(chǎn)生膜亞結(jié)構(gòu)域和四酯蛋白，如CD63、CD81和CD9，在膜上形成簇，誘導(dǎo)囊泡向內(nèi)出芽和EV的形成。此外，細(xì)胞質(zhì)蛋白，如熱休克70kDa蛋白(HSP70)，被歸于來(lái)自大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型的外泌體中。核酸(DNA、mRNA和miRNA)是EV攜帶的另一種重要的分子。miRNA的分類(lèi)是序列依賴(lài)的，導(dǎo)致特定miRNAs在EV中的差異分類(lèi)。總的來(lái)說(shuō)，EV的形成有多種途徑，導(dǎo)致異質(zhì)種群的釋放，可能在大小、組成和功能上存在很大差異。到目前為止，仍然很難根據(jù)分離的囊泡的亞群來(lái)確定一個(gè)特定的途徑。因此，顯然需要更好地理解區(qū)分EV的生物發(fā)生、分類(lèi)和釋放的因素。 國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)(ISEV)推薦使用“EV”作為這些類(lèi)型的囊泡的總稱(chēng)，因?yàn)楹茈y將EV分配給特定的生物發(fā)生途徑，除非通過(guò)實(shí)時(shí)成像技術(shù)在釋放過(guò)程中被捕獲。ISEV還建議根據(jù)EV的物理特征進(jìn)行分類(lèi)，如大小和密度、不同的生化組成和表面電荷量。 一旦EV被釋放到細(xì)胞外空間，它們就會(huì)被受體細(xì)胞內(nèi)化（內(nèi)吞、吞噬或微胞吞作用），然后轉(zhuǎn)移EV的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，進(jìn)一步與靶細(xì)胞的細(xì)胞信號(hào)通路相互作用。EV用于在免疫細(xì)胞[樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)、B細(xì)胞、T細(xì)胞]之間傳遞信息，從而對(duì)免疫應(yīng)答產(chǎn)生免疫抑制或免疫激活作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞使用EV作為信號(hào)傳遞到其他神經(jīng)元細(xì)胞的主要途徑。更重要的是，EV已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病和阿爾茨海默病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的解剖連接區(qū)域之間的傳播中起作用。在心血管系統(tǒng)中，心臟成纖維細(xì)胞EV富含miR-21，這是心肌肥厚的重要旁分泌信號(hào)中介。此外，據(jù)報(bào)道，腫瘤來(lái)源的EV在癌癥的標(biāo)志中發(fā)揮作用，如腫瘤生長(zhǎng)、侵襲性、避免凋亡、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、抵抗和轉(zhuǎn)移。 EV攜帶多種生物物質(zhì)，被認(rèn)為反映了親本細(xì)胞的生理狀態(tài)。EV的成分已經(jīng)在病理生理狀態(tài)的探測(cè)中被研究作為疾病診斷和監(jiān)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。例如，來(lái)自結(jié)直腸癌(CRC)患者血液樣本的上皮來(lái)源EV的miRNA分析顯示，與健康個(gè)體相比，13個(gè)EpCAM+-EVmiRNA水平升高。此外，I期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的EV miRNA圖譜能夠區(qū)分癌癥的不同階段。在蛋白質(zhì)方面，我們發(fā)現(xiàn)CD147在CRC細(xì)胞系分泌的EV以及CRC患者的血清中富集。癌癥患者中CD9和CD147均呈陽(yáng)性的EV水平顯著高于健康供體。盡管這些研究突出了EV的診斷潛力，但EV分離和鑒定方面的挑戰(zhàn)直接影響了EV生物標(biāo)志物的特異性和敏感性，以及它們轉(zhuǎn)化為強(qiáng)大診斷工具的能力。 EV已被用于運(yùn)輸多種治療分子，如siRNA、miRNA和小分子。各種方法，如轉(zhuǎn)染、孵育、超聲處理、循環(huán)凍融和電穿孔處理，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于裝載這些分子。裝載方法的選擇取決于裝載分子的類(lèi)型；例如，對(duì)于小的非編碼RNA(siRNA和miRNA)，分離前轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞和分離后電穿孔是目前首選的方法。小分子抗癌藥物如阿霉素和紫杉醇可通過(guò)孵育被納入EV，并在臨床前研究中顯示了增強(qiáng)的抗腫瘤活性。與其他傳遞載體相比，工程EV提供的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是能夠整合配體，它可以特異性地靶向癌細(xì)胞并逃避免疫反應(yīng)。Kalluri實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)表明，裝載siRNA的CD47+EVs僅靶向KRAS突變的腫瘤，與攜帶類(lèi)似數(shù)量的的脂質(zhì)體相比，顯示出更高的治療效果。來(lái)自Amiji實(shí)驗(yàn)室的研究者使用了一種新的方法來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)自癌細(xì)胞的EV miRNA含量，將巨噬細(xì)胞從M2（原腫瘤）重新編程為M1（抗腫瘤）。此外，EV免疫信號(hào)已被用于產(chǎn)生抗腫瘤作用。最近的一項(xiàng)研究調(diào)查了DC衍生的EV與或不與程序性細(xì)胞死亡-1(PD-1)抗體一起使用索拉非尼治療肝細(xì)胞癌的潛在協(xié)同效應(yīng)�；贓V作為藥物傳遞工具和免疫療法的潛力，一些公司，如Capricor Therapeutics、Codiak Biosciences、Evox Therapeutics和Puretech Health，已經(jīng)開(kāi)始了產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作，將EV療法轉(zhuǎn)化為臨床。在https://ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上搜索關(guān)鍵詞“外泌體”或“細(xì)胞外囊泡”，可以發(fā)現(xiàn)一些臨床試驗(yàn)，這些試驗(yàn)正在招募各種類(lèi)型疾病的患者，包括幾種類(lèi)型的癌癥、神經(jīng)退行性疾病、焦慮、糖尿病和covid-19。由于親本細(xì)胞抗原的表面表達(dá)，DC衍生的外泌體已被用于疫苗傳遞，并在不同類(lèi)型癌癥的多個(gè)I期試驗(yàn)中被證明是安全的。在II期臨床研究中顯示了一些有希望的結(jié)果，使用這些負(fù)載腫瘤抗原的EV作為抗NSCLC聯(lián)合環(huán)磷酰胺的疫苗。盡管EV的治療應(yīng)用取得了這些有趣的進(jìn)展，但在將EV治療轉(zhuǎn)化為臨床方面仍存在一些挑戰(zhàn)。其中一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是親本細(xì)胞通過(guò)各種復(fù)雜的生物發(fā)生途徑產(chǎn)生EV固有成分的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性可導(dǎo)致EV大規(guī)模生產(chǎn)的批次內(nèi)和批間差異。為了將EV成功轉(zhuǎn)化到臨床，識(shí)別影響產(chǎn)品效力和穩(wěn)定性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)（如大小、純度、分子組成）是必不可少的。 這篇綜述全面概述了EV分離和鑒定的傳統(tǒng)和新興的方法，以及這些方法所面臨的主要挑戰(zhàn)。此外，還強(qiáng)調(diào)了實(shí)現(xiàn)所討論方法的標(biāo)準(zhǔn)化的可能途徑，并確定了這些技術(shù)在推廣和標(biāo)準(zhǔn)化方面的潛在好處和缺點(diǎn)。這對(duì)已發(fā)表報(bào)告和對(duì)這些方法優(yōu)缺點(diǎn)的嚴(yán)格評(píng)估將幫助讀者了解當(dāng)前EV研究和確定最有效的路徑選擇，在未來(lái)的相關(guān)研究領(lǐng)域的研究中實(shí)現(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)化感興趣的特定技術(shù)。 二、EV分離：挑戰(zhàn)和需求 1.EV的來(lái)源：EV的異質(zhì)性和復(fù)雜性 EV可從各種生理液體中分離出來(lái)。血液是EV最豐富的來(lái)源之一，估計(jì)濃度為5-15×10^8顆粒/ml。從血液中分離EV的一個(gè)挑戰(zhàn)是它含有脂蛋白[＜35nm，密度1.06-1.20g/cm3，極低、低、高密度脂蛋白(VLDL、LDL、HDL)]和乳糜微粒[75-1100nm，密度＜0.930g/cm3；a.k.a.超低密度脂蛋白(ULDLs)，它在大小和密度上與EV重疊，不能通過(guò)傳統(tǒng)的方法分離(例如，超離心(UC)]。其他影響血液中EV的數(shù)量、純度和異質(zhì)性的因素包括樣本采集、處理、儲(chǔ)存條件、穩(wěn)定性、抗凝劑、采血量、采血時(shí)間、動(dòng)物/患者的年齡、性別、疾病狀態(tài)和喂養(yǎng)/禁食狀態(tài)。在晚期卵巢癌的病例中，會(huì)出現(xiàn)出血性惡性腹水，其中包含各種細(xì)胞類(lèi)型分泌的大量EV，以及細(xì)胞、胞質(zhì)成分和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)片段。這些額外的成分不僅影響EV亞群體的化學(xué)成分，而且還改變了其物理性質(zhì)，如血液的粘度，增加了分離高純度EV群體的難度。進(jìn)一步的異質(zhì)性來(lái)自于從細(xì)胞中釋放出來(lái)的各種囊泡的生物發(fā)生。 2.規(guī)�；屯� 大多數(shù)用于EV分離的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的方法都采用了多個(gè)分離步驟，這給大規(guī)模生產(chǎn)帶來(lái)了挑戰(zhàn)，而且通量很低。近年來(lái)，切向流過(guò)濾(TFF)結(jié)合基于色譜的方法已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于大規(guī)模的基于cGMP的EV生產(chǎn)。這一額外的分離步驟能夠更有效地去除蛋白質(zhì)污染物，并能產(chǎn)生與UC類(lèi)似的EV產(chǎn)量。同樣，基于尺寸排阻的EV分離方案也可以很容易地?cái)U(kuò)大規(guī)模。 3.關(guān)于樣品收集、處理和儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)化的建議 鑒于生物流體的復(fù)雜性和異質(zhì)性，通過(guò)樣品收集、存儲(chǔ)和處理的標(biāo)準(zhǔn)化，盡量減少預(yù)分離和分析前變量至關(guān)重要。這里列出了一些減少下游分離和分析的人為因素影響的建議和措施。 4.樣本收集、樣本匹配、樣本量和數(shù)據(jù)收集 對(duì)于從培養(yǎng)細(xì)胞中分離EV，建議如果可能，使用無(wú)血清培養(yǎng)基，或無(wú)EV血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)補(bǔ)充劑。臨床血液樣本采集，重要的是使用最小化剪切力的針頭，減少血小板活化和血小板和紅細(xì)胞衍生EV的釋放，丟棄第一段收集的血液，靜脈穿刺引起的細(xì)胞碎片也會(huì)造成污染。對(duì)于每個(gè)被收集到的標(biāo)本，親本細(xì)胞也建議盡可能進(jìn)行收集，以實(shí)現(xiàn)分子匹配、圖譜分析、細(xì)胞和EV成分的差異分析，并確定與EV源變化相關(guān)的特定分子特征，如疾病的階段。進(jìn)食/禁食狀態(tài)和樣本采集時(shí)間（晨/晚）影響樣本中的EV水平，但需要更多的研究來(lái)確定最佳參數(shù)。當(dāng)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物和分析EV成分的實(shí)驗(yàn)時(shí)，具有至少80%的統(tǒng)計(jì)功效的樣本量至關(guān)重要。最后，應(yīng)收集有關(guān)患者/動(dòng)物的年齡、性別、種族、疾病狀態(tài)和治療狀態(tài)的信息，以了解這些參數(shù)對(duì)EV含量分析的影響。 5.樣本處理 大多數(shù)已發(fā)表的從血液中分離EV的研究建議使用血漿進(jìn)行分離，因?yàn)檠逯泻醒“鍋?lái)源的EV，這些血小板主要在凝血過(guò)程中釋放。此外，抗凝血?jiǎng)?肝素、檸檬酸、EDTA)的選擇也會(huì)影響研究結(jié)果。許多研究表明，使用EDTA作為下游EV-RNA分析的抗凝劑，因?yàn)樗梢宰柚笶V-細(xì)胞聚集物的形成，抑制血小板來(lái)源的釋放，并且肝素會(huì)抑制PCR反應(yīng)。通過(guò)初步離心分離細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞(WBCs)、血小板），應(yīng)以盡量減少細(xì)胞成分釋放的速度進(jìn)行。此外，必須采取預(yù)防措施，盡量減少加工時(shí)間，以避免樣品由于溫度和酶活性如RNA酶和蛋白酶水解而導(dǎo)致降解。 6.樣品穩(wěn)定性和儲(chǔ)存 許多研究已經(jīng)進(jìn)行了各種生物液體，如尿液、血液和支氣管肺泡灌洗(BAL)評(píng)估各種存儲(chǔ)溫度的影響(4°C?20°C和?80°C)和凍融循環(huán)（一到十）的大小，組成，和功能�？偟膩�(lái)說(shuō)，目前的證據(jù)表明，?80°C是保存EV含量用于下游分子譜分析的最佳溫度。然而，應(yīng)盡量減少凍融循環(huán)，因?yàn)镋V可能會(huì)發(fā)生聚集和裂解，導(dǎo)致高估EV大小，低估EV計(jì)數(shù)，并在分離過(guò)程中造成損失。此外，當(dāng)擬用于藥物傳遞應(yīng)用的EV經(jīng)過(guò)凍融循環(huán)時(shí)，載物的損失會(huì)導(dǎo)致效力的喪失。 三、EV分離方法 需要高效分離EV或EV亞群，并從污染蛋白和其他可能的基質(zhì)污染物中分離出來(lái)，以確保準(zhǔn)確推斷EV或感興趣的特定EV亞群的生物活性和功能。在這里，我們描述了目前和常用的EV分離方法及其優(yōu)缺點(diǎn)（總結(jié)見(jiàn)表1）。 1.UC 目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)是UC，它根據(jù)EV的密度從其他樣品成分中分離和濃縮出來(lái)。EV的密度通常為1.13-1.19g/ml。這個(gè)過(guò)程先將所有細(xì)胞和細(xì)胞碎片分離出來(lái)，然后上清液轉(zhuǎn)移到超離心機(jī)離心兩次100 000xg或更高的速度，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗重懸，減少蛋白質(zhì)污染。然而，這種方法也可以分離出不同大小和組成的MV和微粒，包括病毒、脂蛋白顆粒和蛋白質(zhì)復(fù)合物。UC的通量也很低，需要昂貴的專(zhuān)業(yè)設(shè)備，過(guò)程中也會(huì)破壞EV膜或引起聚集。使用額外的密度梯度步驟，可以進(jìn)一步提高基于UC的EV分離的純度。蔗糖梯度和商業(yè)化OptiPrep密度梯度是常用的方法。這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，可能需要額外的純化步驟來(lái)將EV亞群彼此分離、從其他密度相似的微粒和密度梯度基質(zhì)中分離出來(lái)。 2.SEC 尺寸排除色譜(SEC)根據(jù)水動(dòng)力體積分離樣品的組分。SEC通常使用瓊脂糖CL-2B或類(lèi)似的平穩(wěn)基相柱進(jìn)行，其中組分用PBS洗脫。SEC簡(jiǎn)單穩(wěn)定、可規(guī)�；�，不需要昂貴的設(shè)備，并且可以在溫和的洗脫條件下使用，應(yīng)用廣泛。此外，SEC可能是一種有效的下游蛋白質(zhì)組學(xué)分析的EV分離方法，因?yàn)楦哓S度蛋白還原與UC相當(dāng)或更好。然而，它受到EV分離的低分辨率和稀釋度的限制。有充分的證據(jù)表明，在SEC囊泡分離物中存在污染物，包括脂蛋白顆粒、病毒顆粒、游離蛋白質(zhì)和來(lái)自生物基質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。然而，基于SEC的分離方法的產(chǎn)量和EV：蛋白比值通常都顯著高于基于UC的方法。然而，同樣的研究表明，UC分離比SEC分離產(chǎn)出更多較小EV，并含有更少的載脂蛋白(APO)顆粒。此外，SEC固定相可能與分析物表現(xiàn)出非特異性的相互作用（即離子交換相互作用），從而導(dǎo)致分離選擇性的變化。 3.過(guò)濾法 過(guò)濾使用由分子質(zhì)量和大小定義范圍的基質(zhì)，通常使用纖維素過(guò)濾器。在初始過(guò)濾后，通常包括額外的超濾和洗滌步驟，以去除小于特定尺寸的污染物，并濃縮囊泡樣品�；陔x心的過(guò)濾器(Centricon)已被證明可以回收的顆粒是壓力驅(qū)動(dòng)膜(BioMax)的三倍。聚熱砜納米膜也已成功應(yīng)用。一個(gè)更優(yōu)化版本-TFF，比傳統(tǒng)的過(guò)濾更不容易堵塞。與UC相比，過(guò)濾技術(shù)具有壓力溫和、省時(shí)、純化效果好和可規(guī)�；葍�(yōu)點(diǎn)。此外，分離在很大程度上取決于濾膜的質(zhì)量和膜孔徑分布的均勻性。此外，過(guò)濾可能會(huì)由于擠壓效應(yīng)而改變EV的結(jié)構(gòu)完整性，并導(dǎo)致EV在過(guò)濾膜上損失。因此，該方法對(duì)高復(fù)雜性和高動(dòng)態(tài)范圍的生理液體的適用性可能會(huì)受到低回收率和從高豐度污染物中分離效率不足的限制。 4.基于免疫親和性的分離策略 基于免疫親和的分離策略使用高度特異性的抗體-抗原相互作用來(lái)靶向特定的EV群體，減少受污染的EV和微粒。在許多研究中，已經(jīng)使用抗體分離出了EV。其中一種方法是，生物素化抗體在鏈霉親和素包被的磁珠上捕獲，以分離特定的EV亞群。另一種方法使用基于紙的免疫親和裝置，通過(guò)將抗體偶聯(lián)到色譜紙上，然后使用掃描電子顯微鏡(SEM)或ELISA，針對(duì)已知的特定疾病標(biāo)記物以及肝素的抗體已被用于純化EV并評(píng)估其診斷潛力。免疫親和分離減少了分離時(shí)間，增加了純化的特異性，但成本昂貴，且經(jīng)常受到非特異性結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)性抑制和抗體的交叉反應(yīng)性的困擾。此外，抗體的壽命較短，而且EV從固定階段的特異性釋放可能是不確定的。 5.商業(yè)化試劑 最近，已經(jīng)出現(xiàn)一些商業(yè)化試劑盒來(lái)分離EV，其產(chǎn)量可與基于UC的技術(shù)相當(dāng)，而不需要任何專(zhuān)用設(shè)備。目前已有基于聚合物沉淀的商業(yè)EV分離試劑盒，包括ExoQuick?外泌體沉淀溶液（(Systems Bioscience）、miRCURY(Exiqon)和總外泌體分離試劑(TEIR)（Invitrogen）。像PureExo和MagCapture這樣的非沉淀試劑盒也是有市售的。另一種試劑盒是Exo-Flow，它使用抗體標(biāo)記的磁珠來(lái)靶向表面蛋白�？偟膩�(lái)說(shuō)，這種試劑盒通常也會(huì)導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)污染，需要長(zhǎng)時(shí)間的分離過(guò)程，而且可能會(huì)很昂貴。此外，這種試劑盒的專(zhuān)有配方可能會(huì)干擾下游實(shí)驗(yàn)。Exocuick、miRCURY、TEIR和UC的比較研究顯示，分離的EV大小分布相似。 6.新興技術(shù) 由于EV的研究是一個(gè)相當(dāng)新的領(lǐng)域，新的EV分離技術(shù)正在不斷發(fā)展。在這里，我們將討論最近出現(xiàn)的幾種方法。 （1）微流體 微流控EV分離技術(shù)包括免疫親和捕獲和基于EV的物理或力學(xué)特性（尺寸、密度、可壓縮性、粘彈性等）的捕獲。基于物理性質(zhì)的方法要么是壓力驅(qū)動(dòng)的，要么是電泳驅(qū)動(dòng)的，后者不太容易堵塞孔隙或通道。ExoChip捕獲具有抗cd63抗體功能化的聚二甲基硅氧烷表面修飾的EV，然后進(jìn)行熒光碳氰酸染料染色，以快速定量EV。另一種微流控過(guò)濾裝置利用多孔聚合物單體作為過(guò)濾膜，調(diào)整到不同的幾何形狀和孔徑。粘彈性流和聲分離系統(tǒng)也是新型無(wú)損無(wú)標(biāo)記微流控技術(shù)，可能用于EV分離和尺寸分類(lèi)。這些方法具有樣品量低、成本低、消耗量低、高通量、精度高等優(yōu)點(diǎn)。 （2）不對(duì)稱(chēng)流場(chǎng)流分餾法（AF4） AF4是一種溫和的分離技術(shù)，不需要可能改變、保留和降解EV樣品的固定相。分離是在層流的薄膜（亞毫米）中完成的，層流被限制在一個(gè)底部有膜的狹窄室中，其中施加一個(gè)垂直于層流的力場(chǎng)。與基于色譜的分離方法不同，AF4具有可編程的交叉流強(qiáng)度，可以在分離過(guò)程中進(jìn)行優(yōu)化，以提高效率。最近的研究表明，AF4結(jié)合敏感的分子分析，可以作為一種有效的分離技術(shù)，基于特定的EV和顆粒亞群的大小，從而解決生理液體中EV異質(zhì)性的復(fù)雜性。在線探測(cè)器，包括紫外、多角度光散射(MALS)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)，被有效地用于AF4，將小EV分離成不同的亞群——小外泌體(Exo-S，60-80nm)、大外泌體(Exo-L，90-120nm)和更小外泌體(~35nm)。 （3）納米流式檢測(cè)技術(shù)（Nano-FCM） 通過(guò)對(duì)背景參考噪聲的系統(tǒng)分析，開(kāi)發(fā)了一種基于高分辨流式(FCM)的EV分類(lèi)方法。采用該方法，對(duì)來(lái)自免疫細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯和細(xì)胞微量紫染色EV進(jìn)行了分類(lèi)，保真度分別為78%和99%，[100]。EV FCM的缺點(diǎn)包括可能同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)或多個(gè)EV，或集群檢測(cè)，導(dǎo)致信號(hào)高估和不適當(dāng)?shù)臏y(cè)量，特別是在處理亞微米大小的粒子時(shí)（這里指的并不是NanoFCM納米流式，而是Sony的細(xì)胞流式）。也有可能引入脂蛋白顆粒污染，以及使用不適當(dāng)?shù)某叽鐦?biāo)準(zhǔn)。 （4）多種技術(shù)結(jié)合 為了提高EV分離的特異性或純度，可以結(jié)合多種方法。UC之后的密度梯度步驟，SEC或AF4，已經(jīng)有報(bào)道。另一種組合方法是超濾后液相色譜(LC)，已被證明回收率明顯高于UC，并能保持其生物物理特性。 四、EV的鑒定：挑戰(zhàn)和需求 LDLs的直徑與外泌體相似，而HDLs在所有EV的密度范圍內(nèi)都有存在。當(dāng)使用傳統(tǒng)的方案時(shí)，EV分離物極有可能含有脂蛋白。消除污染蛋白將通過(guò)減少可能的污染物提高表征結(jié)果，然而，使情況更具挑戰(zhàn)性的是，EV的回收率和蛋白質(zhì)產(chǎn)量可能較低，并在分離和樣品處理的后續(xù)步驟中進(jìn)一步損失。此外，雖然有一些常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記，但為所有可能的EV類(lèi)型尋找一個(gè)通用的標(biāo)記Panel或針對(duì)特定EV群體的特定標(biāo)記Panel仍然是該領(lǐng)域的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、有效和經(jīng)濟(jì)有效的方法來(lái)評(píng)估EV分離的純度，將使生物和臨床應(yīng)用成為可能，并將促進(jìn)EV領(lǐng)域急需的標(biāo)準(zhǔn)化。 五、EV表征方法 1.理化表征方法 在表2和圖3中總結(jié)了這些方法。 （1）顯微鏡和成像 利用共聚焦顯微鏡，EV的釋放、攝取和交換可以通過(guò)~200nm分辨率的熒光標(biāo)記細(xì)胞膜來(lái)監(jiān)測(cè)。另一種方法是將用報(bào)告基因標(biāo)記的EV注射到活標(biāo)本中，并通過(guò)各種方法進(jìn)行成像，包括MRI、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描/正電子發(fā)射斷層掃描(spect/PET)或熒光介導(dǎo)斷層掃描(FMT)。這些成像方法可以用來(lái)確定哪些組織和器官的EV被吸收，并可以監(jiān)測(cè)宿主對(duì)EV的降解情況。 使用這些方法監(jiān)測(cè)EV的優(yōu)點(diǎn)是：可以確定它們?cè)谒拗黧w內(nèi)的位置；EV被細(xì)胞產(chǎn)生和吸收時(shí)可以觀察到；可以在動(dòng)物研究中獲得圖像，而不使用侵入性采樣技術(shù)。然而，它也有一些缺點(diǎn)。一種用于標(biāo)記EV的常見(jiàn)染料(PKH67)可以比EV更持久或聚集，形成膠束，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性，導(dǎo)致EV總數(shù)被高估。其他挑戰(zhàn)包括需要高度特異性和穩(wěn)定性的標(biāo)簽，并通過(guò)熒光獲得可靠的EV濃度。 透射電子顯微鏡(TEM)是一種用于識(shí)別樣品中的粒子的成像方法。EV被固定在樣品網(wǎng)格上，并在分析前用醋酸鈾�；蛩难趸~等試劑進(jìn)行染色。電子輻射將分辨率提高到亞納米的分辨率。2D和3D圖像都可以使用各種計(jì)算機(jī)程序來(lái)創(chuàng)建。TEM和冷凍透射電鏡（低溫條件）也可以用于觀察通過(guò)細(xì)胞出芽的EV的形成，可以比較不同細(xì)胞類(lèi)型或條件之間的EV形成。 冷凍透射電鏡的優(yōu)點(diǎn)包括能夠直接觀察樣品，將損傷降低6倍，在樣品制備過(guò)程中盡量減少脫水導(dǎo)致的形態(tài)變化，并且不需要染色程序。然而，使用TEM/冷凍TEM的缺點(diǎn)包括對(duì)將圖像轉(zhuǎn)換為3D的計(jì)算能力需求高，挑戰(zhàn)樣品制備和處理方法，由于冰偽影(cryo-TEM)導(dǎo)致的低信噪比，高成本和低通量。同時(shí)也很難判斷EV是進(jìn)入細(xì)胞還是從細(xì)胞出芽（內(nèi)吞作用和胞吐作用）。由于制備技術(shù)，一些較大的EV可能被排除在外。此外，TEM也不是可靠的定量技術(shù)。因此，如果需要進(jìn)行濃縮，還應(yīng)該使用其他技術(shù)。最近，可以自動(dòng)分析TEM圖像的軟件(TEM ExosomeAnalyzer)被創(chuàng)建出來(lái)，但目前還不能使用冷凍透射電鏡圖像。這樣的軟件工具將減少人類(lèi)主觀判斷所帶來(lái)的誤差。 除了透射電鏡外，原子力顯微鏡(AFM)也是一種高分辨率的EV成像技術(shù)。在一項(xiàng)研究中，AFM被用來(lái)表征血小板衍生的EV，這些EV被捕獲在CD41抗體修飾的云母表面上。結(jié)果顯示，CD41陽(yáng)性EV的數(shù)量和尺寸分布結(jié)果可重復(fù)；更高的分辨率使AFM能夠檢測(cè)到小到幾nm的EV，這遠(yuǎn)比常規(guī)的FCM更靈敏。除了提供EV的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)外，AFM還能夠提供子結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。在一項(xiàng)研究中，在 phase-modulated tapping模式下，成像力從b1 nN到~2 nN，圓形EV在特定階段在中心凹陷處出現(xiàn)變形。這表明EV的密度和成分不均勻，這與之前在不同EV裝載物中的發(fā)現(xiàn)一致。與透射電鏡一樣，有限的通量和專(zhuān)業(yè)設(shè)備要求是AFM的缺點(diǎn)。 （2）DLS DLS，也被稱(chēng)為光子相關(guān)光譜或準(zhǔn)彈性光散射，是一種確定懸浮在流體介質(zhì)中的粒子大小分布的技術(shù)。DLS主要測(cè)量溶液中大分子結(jié)構(gòu)與溶劑分子碰撞引起的布朗運(yùn)動(dòng)速度。通過(guò)DLS測(cè)量尺寸提供了一種簡(jiǎn)單而節(jié)省時(shí)間的技術(shù)，它提供了關(guān)于粒度大小分布的平均尺寸和分散性的信息，從1nm到6μm的粒子的多分散性指數(shù)(PDI)。DLS已被用于一些涉及從血液和BAL等生物液體中分離的EV特性的研究。DLS是單分散樣品尺寸測(cè)量和監(jiān)測(cè)聚集的理想方法，因?yàn)樯⑸鋸?qiáng)度與d^6成正比，其中d是粒子的直徑。在生物流體中，由于存在不同大小的囊泡、顆粒和生物分子，樣品是多分散的，其范圍從幾納米到幾千納米不等。必須去除大顆粒(＞1μm)，如細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞，以及聚集的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物。低分辨率是DLS的一個(gè)重要限制，只有當(dāng)粒子的大小差別至少3倍以上（例如，50nm和150nm）的峰值分辨率才是最好的，導(dǎo)致當(dāng)粒子有一個(gè)接近的粒徑分布時(shí)的結(jié)果展寬嚴(yán)重，PDI值更大。 （3）納米顆粒跟蹤分析(NTA) NTA是一種暗場(chǎng)顯微鏡技術(shù)，基于激光散射跟蹤的粒子的布朗運(yùn)動(dòng)，可以有效地測(cè)量液體懸浮液中的顆粒粒徑分布和濃度。粒子在激光照明下散射光，它們的布朗運(yùn)動(dòng)由配備攝像機(jī)的光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)成像。通過(guò)跟蹤單個(gè)粒子的均方位移，該軟件可以使用斯托克斯-愛(ài)因斯坦方程來(lái)確定其理論水動(dòng)力直徑。與DLS中光散射和粒徑分布偏向于大粒子的情況相比，NTA通過(guò)測(cè)量光散射強(qiáng)度和單個(gè)粒子的大小，為大小不同的非均勻粒子混合物提供了更好的分辨率。此外，NTA可檢測(cè)用穩(wěn)定熒光團(tuán)標(biāo)記的EV。被分析物的折射率(RI)（例如，膠體金的高RI和細(xì)胞來(lái)源的囊泡的低RI）決定了NTA可檢測(cè)到的大小范圍。最小的可檢測(cè)的EV尺寸通常在50nm左右，但信噪比和散射光的量也應(yīng)該被考慮在內(nèi)，以提高測(cè)量的精度。由于布朗運(yùn)動(dòng)很難精確跟蹤，其上限約為1μm，EV定量分析的準(zhǔn)確性也是一個(gè)挑戰(zhàn)。 （4）FCM FCM可以用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，或通過(guò)測(cè)量光散射或樣品顆粒的熒光來(lái)確定EV的大小。樣品可以用熒光標(biāo)記和/或抗體(抗cd63、抗cd81或抗cd9)進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤EV。樣品通過(guò)不同波長(zhǎng)的多個(gè)激光器，即散射光，前向散射(FSC)或熒光的數(shù)量和方向，以及持續(xù)時(shí)間，表示測(cè)量的EV的大小，而側(cè)向散射(SSC)表示內(nèi)部復(fù)雜性。SSC比FSC更敏感，更適合用于低濃度樣品的分析。也有報(bào)道稱(chēng)，使用較低的波長(zhǎng)(405nm)提高了所有EV尺寸的SSC靈敏度和分辨率，對(duì)較小的EV有更顯著的影響。為了提高EV的檢測(cè)水平，可以將親脂性熒光團(tuán)或EV特異性熒光標(biāo)記抗體結(jié)合到EV膜上。對(duì)特定靶蛋白的定性和定量分析可以幫助確定哪個(gè)EV亞群更普遍，這可能對(duì)各種疾病的診斷至關(guān)重要。 FCM的優(yōu)點(diǎn)包括適用于未經(jīng)處理的生物樣品、分析速度快、可重復(fù)和定量。然而，大多數(shù)流式細(xì)胞儀上檢測(cè)不到200nm以下的粒子。為了降低檢測(cè)限，納米流式檢測(cè)儀（NanoFCM）被開(kāi)發(fā)出來(lái)。同樣的原理也適用；然而，收集到的光散射的角度也發(fā)生了變化，允許探測(cè)到40nm的顆粒。如前所述，集群效應(yīng)也會(huì)影響測(cè)量值。不幸的是，由于RIs的差異，光散射標(biāo)準(zhǔn)球并不能正確地與EV尺寸相關(guān)。由于EV的RI低于聚合物標(biāo)準(zhǔn)球，因此EV的測(cè)量尺寸可能是相應(yīng)尺寸標(biāo)準(zhǔn)的兩倍左右。硅球的RI比聚苯乙烯球更類(lèi)似于EV，因此它們可以作為更好的標(biāo)準(zhǔn)。二氧化硅和聚苯乙烯的標(biāo)準(zhǔn)替代品也被引入用于EV FCM分析。例如，脂質(zhì)體或中空的有機(jī)硅珠散射光類(lèi)似于EV。此外，來(lái)自不同制造商的硬件差異可能會(huì)導(dǎo)致差異，在比較來(lái)自不同流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)該考慮到這一點(diǎn)。（NanoFCM使用二氧化硅球作為標(biāo)準(zhǔn)品，比普通流式用PS球更接近生物樣本的折射率。） （5）電阻脈沖傳感器(RPS) RPS是一種基于庫(kù)爾特效應(yīng)測(cè)量溶液中粒子的大小、濃度和電荷的高通量方法。當(dāng)粒子通過(guò)兩側(cè)有電解質(zhì)溶液的膜中亞微米大小的孔時(shí)，測(cè)量施加電流的變化。粒子的大小由電流與背景電流的變化之比決定的。干擾的長(zhǎng)度與粒子的體積有關(guān)，電阻率與濃度有關(guān)。通過(guò)將電阻顆粒信號(hào)與電壓和壓力聯(lián)系起來(lái)，可以測(cè)量zeta電位。在Spectradyne LLC的儀器中，樣品通過(guò)一個(gè)固體孔或孔徑，而Izon Science的儀器有一個(gè)可調(diào)的、可拉伸的孔，可以為特定的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。 RPS是一種很有吸引力的EV表征方法，因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)測(cè)量低至40nm顆粒的尺寸、濃度和zeta電位。該技術(shù)也可以調(diào)整到一個(gè)特定的尺寸范圍，需要大約40μl的樣品。然而，與NTA類(lèi)似，RPS不能確定樣品的顆粒類(lèi)型或化學(xué)組成，這使得很難確定樣品是否含有EV、蛋白質(zhì)聚集物或其他非膜性顆粒（如脂蛋白、碎片）。另一個(gè)問(wèn)題是，RPS和NTA在檢測(cè)較大(＞150nm)和較小(＜150nm)的EV時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不一致：RPS可能傾向于更有效地檢測(cè)較大的粒子，而NTA可能傾向于較小的粒子。挑戰(zhàn)在于確定哪種方法更準(zhǔn)確，或者這兩種方法是否可以串聯(lián)使用，以獲得樣品中EV的更準(zhǔn)確的表征。聚苯乙烯或二氧化硅球，以及潛在的其他標(biāo)準(zhǔn)，被用來(lái)校準(zhǔn)RPS儀器，這為初始標(biāo)準(zhǔn)化提供了依據(jù)。具有不同表面化學(xué)性質(zhì)或脂質(zhì)體的珠子被用來(lái)校準(zhǔn)zeta電位。這種技術(shù)需要頻繁的校準(zhǔn)。在許多研究中，該儀器在每個(gè)樣品之前進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保EV樣品的正確測(cè)量。 （6）新興技術(shù) 拉曼光譜(RS)是基于非彈性光散射，其中光子能量轉(zhuǎn)移到EV分子或從EV分子轉(zhuǎn)移出來(lái)，導(dǎo)致波長(zhǎng)從入射光的波長(zhǎng)偏移。轉(zhuǎn)移能量的量與散射光子波長(zhǎng)的位移成正比，這取決于樣品粒子的分子排列。對(duì)非彈性散射光子的測(cè)量得到了一個(gè)光譜指紋，在外觀上類(lèi)似于紅外光譜。RS以前已被用于來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、細(xì)菌和人類(lèi)樣本的EV。 該方法通常能夠在一次測(cè)量中提供關(guān)于樣品的化學(xué)成分或至少是樣品的主要成分的一些信息，最少只需要準(zhǔn)備50μl樣品。雖然RS似乎可識(shí)別EV，但由于EV的化學(xué)復(fù)雜性，獲取信息光譜具有挑戰(zhàn)性。RS的通量一般，這使得在臨床上使用具有挑戰(zhàn)性。RS可以用于相對(duì)快速的EV測(cè)量，而不需要靶向蛋白生物標(biāo)志物。RS已在工業(yè)上用于小分子；然而，也有研究表明，RS也可以用于EV分析。RS被證明有可能識(shí)別特定囊泡的來(lái)源（如骨髓、脂肪組織、真皮成纖維細(xì)胞）的潛力。本研究開(kāi)發(fā)的方法表明，在EV被用于體內(nèi)或體外臨床應(yīng)用之前，可以進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的批量鑒定。這種方法可用于增加生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供的EV產(chǎn)品的數(shù)量。 頻率鎖定光學(xué)低語(yǔ)倏逝共振（FLOWER）使用一種防腐涂層硅微環(huán)管，其共振頻率被激光探測(cè)。樣品流過(guò)微環(huán)狀光學(xué)諧振器，EV與抗體結(jié)合。每次分析物結(jié)合，共振頻率移動(dòng)和EV濃度計(jì)數(shù)都可獲得。振幅的變化對(duì)應(yīng)于與微環(huán)面結(jié)合或脫離結(jié)合的粒子的直徑。這種方法仍然需要進(jìn)一步的評(píng)估，但它有識(shí)別EV的潛力。 單粒子干涉反射成像(SP-IRI)，作為ExoView系統(tǒng)出售，是基于固定在傳感器表面的粒子（用熒光抗體標(biāo)記）與從傳感器表面反射的光的干擾。干擾可以與大小相關(guān)。這項(xiàng)技術(shù)主要應(yīng)用于病毒，但也開(kāi)始應(yīng)用于EV。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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[考研] 歡迎采礦、地質(zhì)、巖土、計(jì)算機(jī)、人工智能等專(zhuān)業(yè)的同學(xué)報(bào)考 +9 | pin8023 2026-02-28 | 12/600 |
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[考研] 304分材料專(zhuān)碩求調(diào)劑 +8 | qiuzhigril 2026-03-03 | 10/500 |
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[考研] 085601 材料305分求助 +4 | 泡泡郵件 2026-03-03 | 6/300 |
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[考研] 322,求調(diào)劑 +3 | 菜菜愛(ài)玩 2026-03-04 | 3/150 |
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[考研] 276求調(diào)劑 +8 | 路lyh123 2026-02-28 | 10/500 |
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[考研] 085602化學(xué)工程350，調(diào)劑，有沒(méi)有211的 +5 | 利好利好. 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 283求調(diào)劑 +9 | 鹿沫笙 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 268求調(diào)劑 +10 | 簡(jiǎn)單點(diǎn)0 2026-03-02 | 14/700 |
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[考研] 267求調(diào)劑 +6 | 釣魚(yú)佬as 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 好運(yùn)連綿不絕 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 0857調(diào)劑 +6 | 一ll半 2026-02-28 | 8/400 |
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[考研] 307求調(diào)劑 +6 | wyyyqx 2026-03-01 | 6/300 |
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[論文投稿]
通訊作者寫(xiě)誰(shuí)，問(wèn)題是你意想不到的問(wèn)題
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阿爾法啊 2026-03-01 | 3/150 |
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[考研] 考研復(fù)試調(diào)劑，過(guò)國(guó)家線的同學(xué)都可報(bào)名 +7 | 黑！在干嘛 2026-02-28 | 8/400 |
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[考研] 調(diào)劑材料學(xué)碩 +4 | 詞凝Y 2026-03-02 | 4/200 |
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[考研]
 高分子化學(xué)與物理調(diào)劑
+6
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好好好1233 2026-02-28 | 16/800 |
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[考研] 265分求調(diào)劑不調(diào)專(zhuān)業(yè)和學(xué)校有行學(xué)上就 +6 | 禮堂丁真258 2026-02-28 | 9/450 |
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[考研] 317一志愿華南理工電氣工程求調(diào)劑 +6 | Soliloquy_Q 2026-02-28 | 11/550 |
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