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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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Western blot結(jié)果常見問題分析 已有2人參與
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蛋白免疫印跡(western blot即WB),想必做蛋白相關(guān)實(shí)驗(yàn)的小伙伴們都很熟悉,這里就不過(guò)多贅述了,但是做起實(shí)驗(yàn)并沒那么容易。每當(dāng)我們準(zhǔn)備好樣本,滿懷希望自己可以做出這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí) 面對(duì)這些殘忍的現(xiàn)實(shí)時(shí),我們?cè)撛趺淳駬?重復(fù)一次?換個(gè)蛋白?換個(gè)抗體?顯然這些方案都不是更佳的方案。 為了避免出現(xiàn)以上問題 現(xiàn)在就給大家梳理一下western blot中常見問題以及對(duì)應(yīng)的解決方案。 1、條帶形狀不好看怎么回事? 可能的原因有: 1.凝膠的不均勻或聚合不好,應(yīng)對(duì)策略---灌膠前將溶液充分混勻。 2.樣本卦濃度較高.應(yīng)對(duì)策略_--樣本進(jìn)行除卦或者將樣本卦濃度調(diào)成一一致 3..緩沖液多次使用,導(dǎo)致成分發(fā)生變化,應(yīng)對(duì)策略---重新配制。 4.凝膠下部有氣泡.應(yīng)對(duì)策略---電泳前先趕走氣泡。 5.電泳時(shí)溫度過(guò)高應(yīng)對(duì)策略---降低電流或電壓。 2、沒有條帶是怎么回事? 可能的原因有: 1.二抗的HRP活性太強(qiáng)將底物消耗光,應(yīng)對(duì)策略---降低二抗的濃度。 2.ECL底物中H2O2不穩(wěn)定.失活.應(yīng)對(duì)策略_--更換ECL。 3. ECL底物沒有覆蓋到相應(yīng)的位置,應(yīng)對(duì)策略---重新洗膜之后再次曝光。 4.一抗使用不當(dāng)或者二抗失效應(yīng)對(duì)策略---在有效期內(nèi)使用抗體,并對(duì)應(yīng)來(lái)源。 3、背景高咋回事呢? 可能原因有： 1.洗膜不充分,應(yīng)對(duì)策略---建議增加洗液體積和洗滌次數(shù)。 2.電封閉不徹底應(yīng)對(duì)策略---提高封閉液的濃度,孵育時(shí)間,保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜封閉物使用不當(dāng)比如檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可以用脫脂奶粉,應(yīng)對(duì)策略---針對(duì)不同的蛋白使用不同的封閉物。 3.抗體非特異性結(jié)合,應(yīng)對(duì)策略---可以降低抗體的濃度或者減少孵育的時(shí)間。 |
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3樓2021-11-02 19:58:53
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4樓2021-11-03 15:39:04
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