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醫(yī)學(xué)生物科研銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
Western blot結(jié)果常見問題分析 已有2人參與
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蛋白免疫印跡(western blot即WB),想必做蛋白相關(guān)實驗的小伙伴們都很熟悉,這里就不過多贅述了,但是做起實驗并沒那么容易。每當我們準備好樣本,滿懷希望自己可以做出這樣的實驗結(jié)果時 面對這些殘忍的現(xiàn)實時,我們該怎么抉擇?重復(fù)一次?換個蛋白?換個抗體?顯然這些方案都不是更佳的方案。 為了避免出現(xiàn)以上問題 現(xiàn)在就給大家梳理一下western blot中常見問題以及對應(yīng)的解決方案。 1、條帶形狀不好看怎么回事? 可能的原因有: 1.凝膠的不均勻或聚合不好,應(yīng)對策略---灌膠前將溶液充分混勻。 2.樣本卦濃度較高.應(yīng)對策略_--樣本進行除卦或者將樣本卦濃度調(diào)成一一致 3..緩沖液多次使用,導(dǎo)致成分發(fā)生變化,應(yīng)對策略---重新配制。 4.凝膠下部有氣泡.應(yīng)對策略---電泳前先趕走氣泡。 5.電泳時溫度過高應(yīng)對策略---降低電流或電壓。 2、沒有條帶是怎么回事? 可能的原因有: 1.二抗的HRP活性太強將底物消耗光,應(yīng)對策略---降低二抗的濃度。 2.ECL底物中H2O2不穩(wěn)定.失活.應(yīng)對策略_--更換ECL。 3. ECL底物沒有覆蓋到相應(yīng)的位置,應(yīng)對策略---重新洗膜之后再次曝光。 4.一抗使用不當或者二抗失效應(yīng)對策略---在有效期內(nèi)使用抗體,并對應(yīng)來源。 3、背景高咋回事呢? 可能原因有： 1.洗膜不充分,應(yīng)對策略---建議增加洗液體積和洗滌次數(shù)。 2.電封閉不徹底應(yīng)對策略---提高封閉液的濃度,孵育時間,保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜封閉物使用不當比如檢測生物素標記的蛋白時不可以用脫脂奶粉,應(yīng)對策略---針對不同的蛋白使用不同的封閉物。 3.抗體非特異性結(jié)合,應(yīng)對策略---可以降低抗體的濃度或者減少孵育的時間。 |
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2樓2021-11-01 10:04:16
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4樓2021-11-03 15:39:04
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5樓2021-11-29 15:59:38
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