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NanoFCMlxq

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今天分享一篇發(fā)表在Cells（2021年IF=6.6）上的文章，名為《Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular V esicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients》[1]（ 基于血清細(xì)胞外囊泡宏基因組學(xué)分析的中重度銀屑病患者不同菌群的組成特征）。

慢性斑塊狀銀屑病或?qū)こＰ豌y屑病是銀屑病最常見(jiàn)的形式，其臨床特征是位于頭皮、肘部、膝蓋、臍和腰部的紅色和鱗狀皮膚斑塊反復(fù)發(fā)作。銀屑病患者不僅患有炎癥性皮膚病，而且還經(jīng)常患有并發(fā)癥，如高脂血癥、二型糖尿病、肥胖癥、炎癥性腸病(IBD)和心血管疾病。顯然，銀屑病是一種全身炎癥性疾病，開(kāi)發(fā)新的潛在治療策略至關(guān)重要。

原核生物和真核生物分泌的細(xì)胞外囊泡(EVs)負(fù)責(zé)細(xì)胞間的通訊。EVs的不同內(nèi)容物、大小和濃度反映了其來(lái)源細(xì)胞的狀態(tài)，并作為各種病理狀況的生物標(biāo)志物。來(lái)自供體細(xì)胞的EVs的脂質(zhì)雙層膜攜帶內(nèi)容物，如DNA、RNA (microRNA、mRNA、長(zhǎng)非編碼RNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，它們隨后聚集到受體細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中，從而觸發(fā)免疫調(diào)節(jié)。最近，來(lái)自免疫細(xì)胞的EVs被證實(shí)參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制。許多研究表明Th17細(xì)胞和Th17途徑在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著越來(lái)越重要的作用。白細(xì)胞介素-17A (IL-17A)作為T(mén)h17細(xì)胞的下游效應(yīng)分子，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)。有研究表明銀屑病皮損中肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加有助于致病性細(xì)胞因子IL-17A通過(guò)EV形成的釋放。也有研究者檢測(cè)到銀屑病患者體內(nèi)產(chǎn)生IL-17A的外泌體增多。靶向游離IL-17及其受體的藥物是目前治療銀屑病最有效的方法。EVs的釋放是銀屑病炎癥狀態(tài)下角質(zhì)形成細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的雙向交流。銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)分泌型EVs中的特異性microRNAs誘導(dǎo)Th1/Th17細(xì)胞極化，進(jìn)一步促進(jìn)銀屑病發(fā)展。除了免疫細(xì)胞分泌的EVs作為銀屑病的致病因素外，包封的microRNA被認(rèn)為是銀屑病的生物標(biāo)志物。來(lái)自細(xì)菌的EVs，稱為膜泡(MVs)或外膜泡(OMVs)，分別來(lái)源于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，也含有微生物相關(guān)的分子模式(MAMPs)，如核酸、脂多糖(LPS)、肽聚糖或毒素來(lái)調(diào)節(jié)免疫。這些MAMPs被宿主中免疫和非免疫細(xì)胞表達(dá)的不同家族的模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別，并進(jìn)一步觸發(fā)免疫調(diào)節(jié)信號(hào)。無(wú)論真核生物和原核生物分泌的腸道病毒如何，腸道病毒的特點(diǎn)是在循環(huán)系統(tǒng)中運(yùn)輸。皮膚或腸道微生物群的生物失調(diào)是導(dǎo)致先天和適應(yīng)性免疫不足的危險(xiǎn)因素。腸-皮膚軸是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因素。微生物來(lái)源的腸道病毒可在體液中檢測(cè)到，并在微生物與宿主的相互作用中發(fā)揮重要作用。病原體衍生的EVs已被證明可以調(diào)節(jié)疾病的發(fā)展，如中性粒細(xì)胞性肺部炎癥和特應(yīng)性皮炎。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有益微生物來(lái)源的腸道病毒可以改善炎癥并影響遠(yuǎn)端宿主細(xì)胞。對(duì)EV宏基因組的深入分析可能是系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌-宿主關(guān)系的一種極好手段。研究表明，腸道或皮膚微生物群在銀屑病中起著關(guān)鍵作用；然而，沒(méi)有研究分析系統(tǒng)性微生物因素。本研究調(diào)查了銀屑病患者和健康對(duì)照者血清中微生物EVs的多樣性和豐度。全長(zhǎng)16S宏基因組分析確定了生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的細(xì)菌EV分類(lèi)群作為診斷模型。

研究過(guò)程：

一、樣本收集

血清標(biāo)本采集自銀屑病患者(PASI > 10)和既無(wú)皮膚病也無(wú)任何明顯基礎(chǔ)疾病(如代謝綜合征、腸道疾病和癌癥的健康人。在研究前14天內(nèi)，沒(méi)有參與者使用益生菌、全身抗生素或類(lèi)固醇。所有參與者都提供了書(shū)面知情同意書(shū)，以公布其病例詳情。該研究獲得廈門(mén)長(zhǎng)庚醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、EVs分離

通過(guò)一系列超速離心從血液樣本中分離出血漿EVs。首先用5倍的PBS稀釋4ml的血樣以降低粘度，然后在4℃以2000× g離心30分鐘除去碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，并在4℃下以10000× g離心45分鐘。隨后使用0.45 m注射器過(guò)濾器過(guò)濾上清液，在4℃下以100000× g超速離心70分鐘。將外泌體沉淀重懸于10ml冷PBS中，重復(fù)超速離心步驟。將最終的外泌體沉淀重新懸浮在100ul 0.22um過(guò)濾的PBS中，用于后續(xù)分析。

三、TEM

用負(fù)染的透射電鏡觀察分離的外泌體的形態(tài)。將純化的外泌體稀釋兩倍至10ul的體積，并加到銅網(wǎng)格上1分鐘，用濾紙小心除去過(guò)量的外泌體溶液。吸收的外泌體用10ul 2%乙酸鈾酰染色1分鐘，用濾紙除去多余的液體。網(wǎng)格在室溫下干燥幾分鐘，并在80千伏下使用透射電子顯微鏡獲取圖像。

四、納米流式（nanoFCM）檢測(cè)

使用納米流式檢測(cè)儀（N30E，NanoFCM，中國(guó)廈門(mén)）分析血清外泌體的濃度和大小。使用200nm二氧化硅納米球混合物來(lái)校準(zhǔn)分離的血清外泌體的濃度和大小。使用冷PBS (1:4稀釋比)稀釋每個(gè)樣品（20ul），隨后，用20ul FITC小鼠抗人CD9和FITC小鼠抗人CD81抗體(BD Biosciences)在37℃染色30分鐘。同型對(duì)照作為陰性對(duì)照(BD Biosciences)。孵育后，用PBS洗滌兩次，并在4℃下以110000×g離心70分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于50ul冷PBS中。上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

五、Western Blot

使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒評(píng)估EVs的蛋白濃度。使用Western blotting檢測(cè)EV標(biāo)記物：CD9、CD63和calnexin。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，將蛋白質(zhì)裂解物(每孔10ug)加到10%或15%的SDS-PAGE凝膠上。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到甲醇活化的PVDF膜上。在室溫下，將膜在含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液1× TBST中封閉1小時(shí)，然后在4℃下與一抗孵育過(guò)夜。過(guò)量的一抗用TBST洗滌三次來(lái)除去。接下來(lái)，將膜與二抗在室溫下孵育1小時(shí)，隨后在室溫下用Immobilon? Western Chemiluminescent HRP Substrate 孵育5分鐘，使用ChemiScope 3300 mini進(jìn)行化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)。

六、血漿EVs的DNA提取

在提取DNA之前，使用0.22um的過(guò)濾器清除EVs中的細(xì)菌和外源顆粒。EV樣品100℃煮沸30分鐘，再10000× g離心30分鐘。DNA的質(zhì)量和數(shù)量用 NanoDrop測(cè)定。用1%瓊脂糖凝膠確定DNA濃度和純度。

七、文庫(kù)制備和測(cè)序

所有PCR反應(yīng)均采用TransStart?FastPfu DNA Polymerase（TransGen Biotech）。對(duì)于全長(zhǎng)16S rRNA基因測(cè)序，根據(jù)16S宏基因組測(cè)序文庫(kù)制備程序（Pacific Biosciences）使用了一套特異性引物(27F：5'-CCTACGGGNGGCWCAG-3'，1492R：5'-GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3')。PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，用SYBR green loading dye染色。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)純化。測(cè)序文庫(kù)用SMRTbell Template Prep Kit （Pacific Biosciences）生成。文庫(kù)的質(zhì)量用 Qubit 4.0 fluorometer (Thermo Scientific）和Femto Pulse system (Agilent）進(jìn)行評(píng)估。最后，在PacBio測(cè)序平臺(tái)上對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序。

八、 微生物圖譜的處理和分析

使用SMRT Link軟件，在PacBio的官方流程中，循環(huán)一致性序列(CCS)讀數(shù)的最小預(yù)測(cè)精度為0.9，最小通過(guò)次數(shù)設(shè)置為3。多路分解后，用DADA2(版本1.10.1)進(jìn)一步處理CCS讀數(shù)，以獲得單核苷酸分辨率的擴(kuò)增子。DADA2工作流程包括質(zhì)量篩選、去重復(fù)、學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)集特定的誤差模型、擴(kuò)增子序列變異(ASV)推斷和嵌合體去除。對(duì)于每一個(gè)代表性序列，QIIME2中的特征分類(lèi)器和classifyconsensus-blast算法被用來(lái)基于從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的信息來(lái)注釋分類(lèi)。

為了分析不同ASVs之間的序列相似性，使用QIIME2比對(duì)MAFFT對(duì)照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了多序列比對(duì)。主坐標(biāo)分析(PCoA)是使用距離矩陣來(lái)獲取主坐標(biāo)，以可視化復(fù)雜的多維數(shù)據(jù)。LEfSe將LDA應(yīng)用于被鑒定為顯著不同的細(xì)菌分類(lèi)群，并進(jìn)一步評(píng)估每個(gè)差異豐富分類(lèi)群的效應(yīng)大小。在這項(xiàng)研究中，LDA評(píng)分(log 10) > 4的分類(lèi)群被認(rèn)為是顯著的。對(duì)于功能分析，使用PICRUSt (v1.1.1)分析了來(lái)自16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的功能豐度，以預(yù)測(cè)功能基因。

結(jié)果展示：

一、EVs的分離和鑒定

圖1. A. EVs電鏡照片；B. 納米流式（nanoFCM）測(cè)定EVs粒徑分布和 C. 濃度；D. 納米流式（nanoFCM）檢測(cè)EVs標(biāo)志物CD9和CD81的表達(dá)量，以及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照作為陰性對(duì)照；E. Western blot檢測(cè)CD9, CD63和calnexin表達(dá)水平。

二、 健康人和銀屑病患者不同微生物群的差異

圖2. 健康人和銀屑病患者血漿細(xì)菌群落的α多樣性指標(biāo)。

三、 優(yōu)勢(shì)菌在不同染色體水平上的分布

圖3. 健康人和銀屑病患者不同微生物群中的β-多樣性。

圖4. 前10種相對(duì)豐度分布

四、健康人和銀屑病患者微生物群組成的差異分析

圖5. 兩組間物種多樣性分析。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對(duì)的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Chang, CJ; Zhang, J; Tsai, YL; et al.Compositional Features of Distinct Microbiota Base on Serum Extracellular Vesicle Metagenomics Analysis in Moderate to Severe Psoriasis Patients.[J].Cells.2021,10(9):

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銀蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
73樓2022-02-13 14:21:56
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